【摘要】：布魯菌是人畜共患布魯菌病的病原菌,主要引起動(dòng)物流產(chǎn)和人的波狀熱。布魯菌的毒力主要體現(xiàn)在入侵吞噬細(xì)胞并在胞內(nèi)存活和復(fù)制的能力。布魯菌侵入宿主細(xì)胞后通過(guò)表達(dá)一系列的毒力相關(guān)因子來(lái)完成胞內(nèi)存活和復(fù)制過(guò)程,脂多糖(LPS)和Ⅳ型分泌系統(tǒng)(T4SS)是布魯菌最為關(guān)鍵的兩個(gè)毒力相關(guān)因子。根據(jù)LPS的完整性,將布魯菌分為光滑型(S型)和粗糙型(R型)。R型布魯菌能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡,并且該過(guò)程依賴于T4SS。然而,R型布魯菌致死巨噬細(xì)胞的分子機(jī)制還不清楚。本研究利用Luciferase報(bào)告基因、Western blotting、qPCR等方法對(duì)其進(jìn)行了探究,并且利用Label-free蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)T4SS關(guān)鍵效應(yīng)蛋白進(jìn)行篩選鑒定。本研究中,為確定T4SS在R型布魯菌ΔrfbE致死巨噬細(xì)胞中的作用,我們利用FITC-Annexin V/propidium iodide雙熒光染色法和檢測(cè)乳酸脫氫酶釋放量?jī)煞N方法對(duì)S2308、ΔrfbE和ΔrfbEΔvirB123感染巨噬細(xì)胞后的細(xì)胞毒性分別進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。結(jié)果顯示,R型布魯菌ΔrfbE誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡依賴于T4SS。為探究T4SS在ΔrfbE致死巨噬細(xì)胞中的作用,構(gòu)建T4SS分泌蛋白BPE123和VceC的融合Luciferase報(bào)告菌株對(duì)S2308、ΔrfbE和ΔrfbEΔvirB123的T4SS分泌水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明ΔrfbE融合蛋白BPE123-Luc或Luc-VceC的分泌水平明顯高于S2308。進(jìn)一步對(duì)S2308和ΔrfbE的T4SS表達(dá)差異分別用qPCR和Western blotting進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,在TSB、酸性和營(yíng)養(yǎng)匱乏條件下,R型布魯菌ΔrfbE的T4SS表達(dá)量顯著高于S型布魯菌S2308。T4SS啟動(dòng)子virB的Luciferase報(bào)告菌株的檢測(cè)結(jié)果表明,ΔrfbE的virB啟動(dòng)子活性顯著高于S2308。上述試驗(yàn)結(jié)果表明,T4SS的表達(dá)和分泌能力在R型布魯菌中顯著高于S型布魯菌。為探究R型布魯菌ΔrfbE T4SS上調(diào)表達(dá)的原因,我們利用qPCR分析了T4SS的調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示,與S2308相比,ΔrfbE的VjbR上調(diào)表達(dá),MdrA和BlxR下調(diào)表達(dá)。為確定VjbR、MdrA和BlxR在ΔrfbE致死巨噬細(xì)胞中的作用,構(gòu)建了ΔrfbE的VjbR缺失株以及MdrA和BlxR的過(guò)表達(dá)菌株,并對(duì)這些菌株的細(xì)胞毒性進(jìn)行了定性和定量檢測(cè)。結(jié)果表明,ΔrfbE缺失VjbR后不再具有細(xì)胞毒性;ΔrfbE過(guò)表達(dá)BlxR后細(xì)胞毒性顯著降低;但ΔrfbE過(guò)表達(dá)MdrA后細(xì)胞毒性仍然很強(qiáng)。為研究VjbR和BlxR對(duì)T4SS的調(diào)控作用,我們利用qPCR分析了ΔrfbEΔvjbR和ΔrfbE(pBlxR)菌株的virB4的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,VjbR對(duì)ΔrfbE的T4SS過(guò)表達(dá)起到了關(guān)鍵的作用,而B(niǎo)lxR只起到了一定的作用。R型布魯菌激活巨噬細(xì)胞凋亡或焦亡與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力應(yīng)激IRE1α信號(hào)通路相關(guān),為探究R型布魯菌ΔrfbE的T4SS分泌上調(diào)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響,利用Western blotting鑒定了S2308和ΔrfbE感染巨噬細(xì)胞后IRE1α磷酸化(p-IRE1α)水平。結(jié)果顯示,與S2308相比,ΔrfbE引起更強(qiáng)烈內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。運(yùn)用p-IRE1α專性抑制劑4μ8c處理細(xì)胞后檢測(cè)ΔrfbE對(duì)巨噬細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示,抑制p-IRE1α后ΔrfbE對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性顯著降低。該系列結(jié)果表明,R型布魯菌通過(guò)VjbR上調(diào)和BlxR下調(diào)表達(dá)協(xié)同調(diào)控T4SS的轉(zhuǎn)錄并激活I(lǐng)RE1α信號(hào)通路致死巨噬細(xì)胞。我們對(duì)S2308、ΔrfbE和ΔrfbEΔvirB123進(jìn)行了差異分泌蛋白質(zhì)組學(xué)分析,以期篩選到致死巨噬細(xì)胞中起到關(guān)鍵作用的T4SS效應(yīng)蛋白。將三個(gè)菌株在RPMI-1640營(yíng)養(yǎng)缺乏培養(yǎng)基中誘導(dǎo)8 h制備分泌蛋白樣品,發(fā)現(xiàn)R型布魯菌的蛋白分泌量明顯高于S型布魯菌。質(zhì)譜分析共鑒定肽段數(shù)9020個(gè),蛋白質(zhì)組數(shù)1131個(gè)。GO分析發(fā)現(xiàn),差異蛋白主要參與細(xì)胞過(guò)程和代謝過(guò)程等重要的生物學(xué)過(guò)程,集中分布在細(xì)胞和細(xì)胞組分,具有催化活性和結(jié)合活性的分子功能。KEGG分析發(fā)現(xiàn),差異蛋白主要位于氨基酸的生物合成、雙組份系統(tǒng)、碳代謝、嘌呤代謝、核糖體、NOD樣受體信號(hào)通路、細(xì)菌分泌系統(tǒng)等重要通路。運(yùn)用細(xì)菌的定向缺失和過(guò)表達(dá)技術(shù)分析了差異分泌蛋白對(duì)S型和R型布魯菌細(xì)胞毒性的影響,結(jié)果顯示,OmpW蛋白(BAB1_1579)和假定蛋白(BAB1_1185)與布魯菌的細(xì)胞毒性密切相關(guān)。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)R型布魯菌ΔrfbE致死巨噬細(xì)胞與其T4SS的組分無(wú)關(guān),而是T4SS分泌的某些效應(yīng)蛋白起到了關(guān)鍵作用。綜上所述,本研究揭示了R型布魯菌ΔrfbE通過(guò)上調(diào)表達(dá)VjbR和virB操縱子的轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致T4SS的過(guò)表達(dá)并分泌過(guò)量的T4SS效應(yīng)蛋白,在VceC、OmpW蛋白(BAB1_1579)和假定蛋白(BAB1_1185)等多種分泌蛋白的作用下過(guò)激活p-IRE1α引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力應(yīng)激最終導(dǎo)致巨噬細(xì)胞死亡。本研究為粗糙布魯菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡的分子機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。
【圖文】：

從而拓寬了布魯菌的宿主范圍。B. melitensis、B.強(qiáng)的致病性并且能夠感染人，而其他幾種菌株對(duì)人的致病性Zsuzsanna Rónai 等人從野豬上分離到了布魯菌 B. microti(R染的宿主范圍還在不斷地?cái)U(kuò)大。方式主要是消化道傳播，但是在存在氣溶膠的條件下也可布魯菌病可以通過(guò)產(chǎn)前三個(gè)月的流產(chǎn)進(jìn)行傳播，在此過(guò)程中至自然環(huán)境中，從而被易感動(dòng)物攝取，從而形成了布魯菌病erson et al., 1986; Atluri et al., 2011)。在自然宿主中，布魯菌液和生殖分泌物進(jìn)行傳播(Anderson, et al., 1986;Atluri, et a食用未經(jīng)高溫消毒的牛奶或來(lái)自山羊和牛的奶制品。另外感染布魯菌病的重要傳播方式。但是，很少有人與人之間傳中的傳播方式如圖 1.1 所示。有報(bào)道表明臨床實(shí)驗(yàn)室里布魯播的一種重要方式(Ariza et al., 2007)。另外，，面蠅能夠攝入，表明昆蟲(chóng)在布魯菌病的傳播中也起到了一定的作用(Che

論文 分的被溶酶體降解，其中有 90%的布魯菌被殺死(Celli機(jī)制逃避了宿主的殺傷機(jī)制，這可能涉及 BCV 的酸化釋放大量的效應(yīng)分子進(jìn)入宿主細(xì)胞的胞質(zhì)(Boschiroli,菌能夠在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上存活并建立復(fù)制小體進(jìn)行大量繁殖(網(wǎng)不是布魯菌的終點(diǎn)，自噬樣液泡能夠?yàn)椴剪斁峁┳允傻奶攸c(diǎn)，也稱為自噬 BCV（aBCV），它的形成是所必需的(Starr et al., 2012)�？偟膩�(lái)說(shuō)，布魯菌在宿主
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 尹穩(wěn);伏旭;李平;;蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通報(bào);2014年01期

2 吳艷;權(quán)亞瑋;;奶牛場(chǎng)防控布魯氏菌病存在的問(wèn)題及凈化措施[J];畜牧與飼料科學(xué);2010年05期

3 曹小安;邱昌慶;秦天達(dá);;布魯氏菌毒力基因的研究狀況[J];中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào);2009年07期

4 齊景文;布魯氏菌病概述[J];中國(guó)獸醫(yī)雜志;2004年09期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 田明星;流產(chǎn)布魯氏菌毒力基因篩選鑒定及其功能研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 黎銀軍;我國(guó)布魯氏菌病時(shí)空分布及風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2013年

2 任曉莉;布魯氏菌強(qiáng)弱毒株誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡機(jī)制初步研究[D];石河子大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2593994