【摘要】：仔豬腹瀉是養(yǎng)豬業(yè)中普遍存在的一種腸道疾病,嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的經(jīng)濟效益。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens type C,C.perfringens type C)是引起仔豬腹瀉的細菌性病原菌之一,它能夠黏附到腸道上皮,并釋放多種毒素損傷并破壞腸絨毛、黏膜和內(nèi)皮細胞等,引起仔豬腹瀉。盡管通過疫苗預(yù)防和抗生素治療在一定程度上減少和控制了仔豬C型產(chǎn)氣莢膜梭菌性腹瀉的發(fā)生,但長期使用抗生素導(dǎo)致病原菌耐藥性增強,且對食品安全和人類健康帶來隱患;病原菌的變異也不斷為疫苗的研發(fā)提出挑戰(zhàn),使得對仔豬腹瀉的防治難度不斷加大。LncRNA(long noncoding RNA)是一類長度大于200nt的非編碼RNA,能夠激活或抑制蛋白編碼基因的表達,在機體防御病原菌感染的過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究已證明lncRNA和mRNA的差異表達與大腸桿菌和沙門氏菌感染導(dǎo)致的仔豬腹瀉疾病密切相關(guān),但有關(guān)其對仔豬C型產(chǎn)氣莢膜梭菌腹瀉的調(diào)控機制研究未見報道。開展仔豬C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染性腹瀉抗性的調(diào)控機制研究,篩選對仔豬腹瀉具有重要調(diào)控功能的lncRNA和mRNA,對于從遺傳上提高仔豬抗腹瀉能力和培育腹瀉抗性豬品系具有重大的意義。鑒于此,本研究利用C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染7日齡健康二元仔豬,通過總腹瀉評分和糞便C型產(chǎn)氣莢膜梭菌細菌計數(shù)等試驗篩選C型產(chǎn)氣莢膜梭菌耐受型(IR)和易感型(IS)仔豬;采用RNA-seq和生物信息學(xué)方法獲得耐受組、易感組和對照組(IC)仔豬回腸組織lncRNA和mRNA差異表達譜;對差異表達lncRNA和mRNA進行功能富集分析;篩選仔豬C型產(chǎn)氣莢膜梭菌腹瀉抗性相關(guān)基因。通過以上研究探索lncRNA和mRNA在C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染導(dǎo)致仔豬腹瀉過程中的調(diào)控機制。主要研究結(jié)果如下:1.C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染對仔豬的體重、腹瀉評分和糞便C型產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量的影響顯著,且IR和IS組仔豬之間差異顯著。與IC組相比,IR和IS組仔豬的總腹瀉評分、糞便細菌數(shù)量均上升,體重、心、肝、脾等重量下降;IR組仔豬的腹瀉評分、糞便細菌數(shù)量顯著低于IS組仔豬(P0.05),IR組仔豬的體重、心、肝和脾等重量顯著高于IS組仔豬(P0.05)。2.lncRNA和mRNA的表達譜分析結(jié)果表明:在IR、IS和IC三組間共發(fā)現(xiàn)到3640個lncRNA(1850個新lncRNA和1890個注釋lncRNA)和25491個mRNA。與mRNA相比,這些lncRNA具有較低的外顯子數(shù)、較短的長度、較低的表達量、低保守性和無編碼潛能等特征。差異表達分析共篩選出IR、IS和IC三組中有480個差異表達lncRNA和3669個差異表達mRNA,其中4個lncRNA和28個mRNA在IRvsIC、ISvsIC和IRvsIS三對比組中共同差異表達。3.差異表達lncRNA和mRNA的功能富集分析結(jié)果顯示:與IC組相比,IR和IS組差異表達lncRNA和mRNA富集的功能和信號通路相似,其顯著富集的GO功能主要包括細胞功能、轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體激活、氨基酸代謝、生物合成和代謝等與細胞和免疫相關(guān)的GO功能;其富集的KEGG信號通路主要包括氧化磷酸化、ABC轉(zhuǎn)運、脂肪酸代謝、移植物抗宿主反應(yīng)疾病等與代謝、分子合成和轉(zhuǎn)運和免疫相關(guān)的信號通路。4.篩選出與C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染性疾病相關(guān)的212個差異表達lncRNA通過cis或trans作用方式及其靶向調(diào)控的505個差異表達mRNA關(guān)系對,其中25個lncRNA對13個免疫相關(guān)基因具有潛在的調(diào)控關(guān)系。5.IRvsIS組中差異表達lncRNA的功能預(yù)測和分析結(jié)果表明:IRvsIS對比組中7個差異表達lncRNA的差異表達靶mRNA主要富集在MHC I類蛋白復(fù)合體、免疫反應(yīng)、抗原加工和遞呈、I-κB/NF-κB信號的調(diào)控等GO功能;以及細胞粘附分子、炎癥性腸炎、T細胞受體信號通路、自然殺傷細胞介導(dǎo)細胞毒性、細胞因子受體互作等免疫相關(guān)的通路。6.qPCR檢測結(jié)果表明:IR和IS組IRAK3、LCP2和TLR8的表達量極顯著低于IC組(P0.01),IS組TNFRSF11A和CYP1A1的表達量極顯著高于IC組(P0.01),且IR組和IS組的TLR8和CYP1A1的表達量差異顯著(P0.05)。IR和IS組NF-κB和IFN-α表達量顯著高于IC組,且IR和IS組之間差異顯著,IR組IL-1β和TNF-α表達量顯著高于IC組(P0.05)。綜上所述,lncRNA可能通過調(diào)控其靶基因的表達,影響細胞因子的水平,并通過影響仔豬腸道的能量代謝、受體激活和免疫等功能參與仔豬抵抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染導(dǎo)致的腹瀉疾病。本研究可為仔豬C型產(chǎn)氣莢膜梭菌腹瀉抗性的調(diào)控機制和腹瀉抗性豬品系的分子輔助育種研究研究提供重要參考。
【圖文】：

圖 1-1 C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染仔豬引起腹瀉的過程Figure 1-1 Key events of C.perfringens type C induced diarrhea in pigs注：圖片引自 Roos S, Wyder M, Candi A, et al. Binding Studies on Isolated Porcine Small IntestinalMucosa and in vitro Toxicity Studies Reveal Lack of Effect of C. perfringens Beta-Toxin on the

RNA-seq測序流程
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.28

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本文編號：2592101