【摘要】：禽白血病是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)/肉瘤病毒群病毒引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱。根據(jù)病毒囊膜蛋白的抗原性,ALV可分為A～J 10個亞群,以及新鑒定的K亞群。其中,對雞具有致病性的外源性ALV包括A、B、C、D、J和K亞群。自1908年首次報道并分離到ALV以來,世界上許多國家都有該病的發(fā)生和流行,我國肉雞、蛋雞及地方品種雞群也普遍存在ALV的感染。除典型的腫瘤性病變外,ALV感染引起的免疫抑制、生長遲緩、產(chǎn)蛋下降等亞臨床表現(xiàn)所造成的經(jīng)濟(jì)損失更為嚴(yán)重。禽白血病是垂直傳播性疫病,至今尚無有效的藥物和疫苗可供使用,控制該病最有效的措施是通過病原檢測,淘汰陽性雞,達(dá)到凈化種群的目的。國際育種公司在20世紀(jì)80年代末就實現(xiàn)了對經(jīng)典外源性ALV的凈化,2005年前后又實現(xiàn)了 ALV-J的基本凈化。國內(nèi)一些自繁自養(yǎng)的育種公司從2002年起也開始在種雞核心群開展禽白血病凈化,有些已取得顯著效果。但在大多數(shù)黃羽肉雞和眾多地方品種雞群中,禽白血病仍在流行和蔓延,對我國家禽種質(zhì)資源的安全構(gòu)成了極大威脅。本研究對某原種場保存的20多個地方品種雞進(jìn)行了禽白血病流行病學(xué)調(diào)查,全面了解地方品種雞群禽白血病感染動態(tài);并對分離到的一株ALV-K全基因組做了系統(tǒng)分析,解析其來源及分子特性;針對地方品種雞群流行最廣的ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K,建立了多重PCR檢測方法;為豐富禽白血病檢測凈化技術(shù),對種公雞精液ALV檢測方法進(jìn)行了摸索和可行性分析;在此基礎(chǔ)上,對DX、LY、XJ和LH 4個地方品種雞核心群開展了禽白血病凈化示范,驗證和完善凈化技術(shù)方案,為原種場禽白血病凈化提供參考依據(jù)。1.地方品種雞群禽白血病流行病學(xué)調(diào)查為深入了解我國地方品種雞群禽白血病流行情況,2013～2017年間對某原種場從全國各地收集并保存的26個地方品種雞開展了禽白血病流行病學(xué)調(diào)查,包括血清學(xué)ALV-J和ALV-A/B抗體檢測、蛋清p27抗原檢測、血漿和組織病料病毒分離檢測等;對部分外源性ALV分離株前病毒DNA的env基因進(jìn)行克隆和測序,將分離株gp85氨基酸序列與GenBank登錄的各亞群ALV參考株進(jìn)行比對和繪制遺傳進(jìn)化樹,鑒定病毒亞群,并進(jìn)行序列分析。血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,有22個雞種ALV-J抗體呈陽性,18個雞種ALV-J和ALV-A/B抗體呈雙陽性,且絕大多數(shù)(19/26)雞種ALV-J抗體陽性率高于ALV-A/B抗體,個別雞種ALV-J抗體陽性率大于50%。蛋清p27抗原檢測結(jié)果顯示,各品種雞群均存在排毒狀態(tài)的母雞,尤其YJ、WX、BJ、DJ和ZJ雞種蛋清p27抗原陽性率高于50%。血漿病毒分離檢測結(jié)果表明,各品種雞對ALV均易感,感染水平存在顯著差異;大部分(15/21)雞種母雞病毒血癥陽性率高于公雞,但差異不顯著。56個外源性ALV分離株經(jīng)亞群鑒定,27株為ALV-J,17 株為 ALV-K,8 株為 ALV-B,3 株為 ALV-A,1 株為 ALV-C。其中,有 9 株 ALV-J、3株ALV-K、1株ALV-A分離自組織病料;其余毒株均分離自表觀健康雞群血漿樣品。表明,ALV-K已成為除ALV-J外,對地方品種雞感染最嚴(yán)重的外源性ALV。與參考株相比,ALV分離株gp85氨基酸序列普遍存在點突變、插入或缺失性變異,部分變異呈規(guī)律性。研究結(jié)果證實了禽白血病在地方品種雞群感染的普遍性和復(fù)雜性,開展禽白血病凈化工作勢在必行。2.K亞群禽白血病病毒全基因組測序及分析為全面了解ALV-K基因組特性,本研究對在流行病學(xué)調(diào)查過程中從LY雞種血漿樣品分離鑒定的一株ALV-K(JS13LY19株)前病毒DNA進(jìn)行了分段克隆和測序,獲得全長基因組序列,并將其各基因片段與GenBank登錄的ALV參考株進(jìn)行比對分析。結(jié)果顯示,JS13LY19株基因組全長7483bp,符合復(fù)制完整C型反轉(zhuǎn)錄病毒特征,缺乏腫瘤基因。其gp85氨基酸序列與ALV-K參考株一致性90.9%～98.6%,顯著高于其它亞群ALV,遺傳進(jìn)化樹上與ALV-K參考株劃為同一支;其中,與ALV-K原型株JS11C1一致性最高,二者顯示出較多位點的規(guī)律性變異,但也存在5個位點差異。JS13LY19株gag、pol、gp37、LTR、UTR與內(nèi)源性ALV顯示更高的一致性(92.0%～99.4%);LTRU3區(qū)比大部分外源性ALV LTR少了一個CAAT enhancer盒、PRE盒、CArG盒及Y盒。推測,JS13LY19株極有可能是JS11C1株與內(nèi)源性ALV重組產(chǎn)生。擁有內(nèi)源性ALVLTR及U3區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的部分缺失,可能使JS13LY19株轉(zhuǎn)錄能力下降而致病性降低,其生物學(xué)特性有待進(jìn)一步研究。3.禽白血病病毒多重PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,雞群中存在的外源性ALV主要包括ALV-J、ALV-K、ALV-A和ALV-B。為快速掌握雞群感染狀態(tài),本研究針對ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K參考株,設(shè)計了一條通用上游引物PF和四條特異性下游引物AR、BR、JR和KR,通過構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,對最適引物濃度、退火溫度、循環(huán)數(shù)等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了一種能同時檢測ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K的多重PCR方法,并對其特異性、敏感性和重復(fù)性進(jìn)行了驗證,將其應(yīng)用于從地方品種雞群分離的119份ALV樣品的檢測中。試驗結(jié)果顯示,使用 0.2 μM PF、0.1 μM AR、0.1 μM BR、0.1 μM JR 和 0.1 μM KR,56.0℃退火溫度和30個循環(huán)的反應(yīng)條件,建立的多重PCR方法檢測效果最優(yōu),能檢測出最低10 pg/μL的ALV前病毒DNA樣品,特異性高,重復(fù)性好。對ALV樣品的檢測結(jié)果與流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果基本相符,并能更高效地檢測出ALV的多重感染。表明,地方品種雞群除單一感染外,還存在 ALV-B+J、ALV-J+K 的二重感染,以及 ALV-A+B+J、ALV-A+B+K、ALV-B+J+K的三重感染。本研究為禽白血病流行病學(xué)調(diào)查及外源性ALV初步鑒定提供了技術(shù)支撐。4.種公雞精液禽白血病病毒檢測方法研究與應(yīng)用選擇合適的檢測材料與方法對禽白血病凈化會起到事半功倍的效果,為探討種公雞精液ALV檢測的可行性與實用性,本研究對LK品種種公雞精液經(jīng)過濾、稀釋、離心、凍融等不同處理方法,以及精液不同稀釋度對病毒分離效果的影響進(jìn)行了研究,并將確定的檢測方法應(yīng)用于LK、MQ和LH 3個品種種公雞的檢測凈化中,同時與血漿病毒分離或血漿斑點雜交檢測結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果,以血漿病毒分離為標(biāo)準(zhǔn),精液樣品經(jīng)稀釋離心后,取上清接種DF-1細(xì)胞,確保在培養(yǎng)基中最終稀釋度為1:28～1:56時病毒分離效果最佳。初步應(yīng)用結(jié)果顯示,不同雞種精液p27抗原ELISA檢測陽性率均最高,但并不能將血漿和精液病毒分離檢測為陽性的雞均檢出,存在“假陰性”;同一雞種血漿和精液病毒分離陽性率高低不同,在LK和MQ種公雞中,二者陽性符合率均低于50%,兩種方法不可互相取代;LH種公雞精液病毒分離陽性率顯著高于血漿病毒分離,亦高于血漿斑點雜交,二者陽性符合率分別為100%和36.4%,精液病毒分離效果優(yōu)于血漿病毒分離。研究結(jié)果提示,對種公雞精液進(jìn)行ALV檢測具有可行性和必要性,由于不同雞種凈化進(jìn)程不同、帶毒排毒狀態(tài)不一,檢測方法也應(yīng)靈活運用。本研究為種禽場禽白血病凈化材料的選擇與方案制定提供了參考依據(jù)。5.地方品種雞群禽白血病示范性凈化本研究在2013～2016年間對原種場保存的DX、LY、XJ和LH 4個雞種核心群開展了禽白血病凈化,通過新建凈化雞舍,采用1日齡胎糞p27抗原檢測、6周齡血漿病毒分離、25～27周齡血漿/精液病毒分離+蛋清p27抗原檢測、36～40周齡血漿/精液病毒分離+蛋清p27抗原檢測等凈化方案,在強(qiáng)化飼養(yǎng)管理的基礎(chǔ)上,經(jīng)過2～3個世代凈化,各品種雞群取得了顯著凈化效果。DX雞種經(jīng)過3個世代凈化,25～27周齡蛋清p27抗原陽性率由26.4%降至0.3%,36～40周齡血漿病毒分離陽性率由36.4%降至0.4%,公雞病毒分離陽性率連續(xù)2個世代均為零;LY雞種經(jīng)過3個世代凈化,6周齡血漿病毒分離陽性率由33.2%降至1.2%,36～40周齡蛋清p27抗原和血漿病毒分離陽性率均降至零;XJ雞種經(jīng)過2個世代凈化,留種前血漿病毒分離陽性率由61.8%降至0.9%;LH雞種經(jīng)過2個世代凈化,留種前蛋清p27抗原陽性率由20.7%降至1.9%,血漿病毒分離陽性率降至0.2%。禽白血病凈化對種雞生產(chǎn)性能的影響,以DX雞種為例,經(jīng)過3個世代凈化,育雛期、育成期和產(chǎn)蛋期死亡率均逐級下降,凈化第一世代效果最為顯著;產(chǎn)蛋性能亦明顯提高,43周齡總產(chǎn)蛋數(shù)平均增加了 13枚/只,66周齡總產(chǎn)蛋數(shù)平均增加了 23枚/只。本研究為眾多地方品種雞群及原種場禽白血病凈化工作的開展起到了良好的示范作用。
【圖文】：

１．１．１病毒分類地位逡逑根據(jù)國際病毒分類委員會（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ邋Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ邋ｏｎ邋Ｔａｘｏｎｏｍｙ邋ｏｆＶｉｒｕｓｅｓ，ＩＣＴＶ）發(fā)逡逑布的第九次分類報告（２０１１），，如圖１－１所７Ｋ，禽白血病病毒（Ａｖｉａｎ邋ｌｅｕｋｏｓｉｓ邋ｖｉｒｕｓ，ＡＬＶ）逡逑屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科、正反轉(zhuǎn)錄病毒亞科、甲型反轉(zhuǎn)錄逡逑病毒屬，且是該屬的代表種。與ＡＬＶ同為甲型反轉(zhuǎn)錄病毒屬的還有羅逡逑斯肉瘤病毒（Ｒｏｕｓ邋ｓａｒｃｏｍａ邋ｖｉｒｕｓ，ＲＳＶ）、禽癌病毒－米爾希爾邋２邋株（Ａｖｉａｎ邋ｃａｒｃｉｎｏｍａ邋Ｍｉｌｌ邋Ｈｉｌｌ逡逑ｖｉｒｕｓ邋２）、禽成髓細(xì)胞瘤病毒（Ａｖｉａｎ邋ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ邋ｖｉｍｓ）、禽骨髓細(xì)胞瘤病毒２９株（Ａｖｉａｎ逡逑ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ邋ｖｉｒｕｓ邋２９）等。逡逑Ｖｉｒｕｓ邋Ｔａｘｏｎｏｍｙ：邋２０１８邋Ｒｅｌｅａｓｅ逡逑ｔ邋Ｃ邋５＾邐ＯＣ逡逑ｔｍＭｉ逡逑Ｉ？＇：二’艾－ｆ－ｔｔ邋二人

譯產(chǎn)生前體蛋白質(zhì)和成熟蛋白質(zhì)并組裝成病毒粒子。前病毒ＤＮＡ具有病毒ＲＮＡ相同的基逡逑因組序列，僅在兩端延長形成Ｕ３－Ｒ－Ｕ５重復(fù)序列，成為長末端重復(fù)序列（ＬＴＲ），ＬＴＲ在逡逑前病毒ＤＮＡ整合及病毒ＲＮＡ復(fù)制、翻譯中起重要作用。ＡＬＶ前病毒基因組結(jié)構(gòu)見圖１－３＿。逡逑？５邋ＬＴＲ－邐－３邋Ｉ．ＴＫ逡逑－５ＵＴＲ邐ｇａｇ邐Ｐ0ｌ邐邋－３－ｌＪＴＲ－逡逑｜１邋；？？逡逑Ｕ３邋Ｋ邋Ｕ５邋ｆｉｌ９邋ｐｉ0ｐ２７ｐｌ２ｐ，５邋ＲＴ邐ＩＮ邐ｇｐ８５邋Ｂ，＇邐Ｕ３邋Ｒ邋Ｕ５逡逑圖１－３邋ＡＬＶ前病毒基因組結(jié)構(gòu)示意圖逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＡＬＶ－Ｊ邋ｐｒｏｖｉｒｕｓ邋ｇｅｎｏｍｅ逡逑根據(jù)致瘤性的快慢，ＡＬＶ可分為慢性轉(zhuǎn)化型ＡＬＶ和急性轉(zhuǎn)化型ＡＬＶ［１８］。急性轉(zhuǎn)化型逡逑病毒感染后可很快誘發(fā)腫瘤，大部分急性轉(zhuǎn)化型ＡＬＶ是復(fù)制缺陷病毒，其部分ｇｆｌｇ、ｐｏ／逡逑或基因被腫瘤基因所取代，不能單獨形成完整的病毒粒子，必須以復(fù)制完整型ＡＬＶ作逡逑為輔助病毒，方可復(fù)制、感染宿主細(xì)胞［１９］。至今已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤基因可整合進(jìn)ＡＬＶ基因逡逑組中，如邋ｓｒｃ、ｆｐｓ、ｙｅｓ、ｒｏｓ、ｅｙｋ、ｊｕｎ＇邋ｑｉｎ、ｍａｆ、ｃｒｋ、ｅｒｂＡ、ｅｒｂＢ、ｓｅａ、ｅｔｓ、ｍｙｂ、ｍｙｃ、逡逑ｍ／／基因等［２Ｑ］。這些腫瘤基因多數(shù)來自細(xì)胞染色體基因組，發(fā)揮著生長調(diào)控作用［２１￣２３］。慢逡逑性轉(zhuǎn)化型ＡＬＶ基因組不含腫瘤基因
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.31

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本文編號：2591575