【摘要】：牦牛是地理分布非常有限的偶蹄動物之一,也是高寒地區(qū)特有牛種,更是高原地區(qū)支柱產(chǎn)業(yè),當?shù)啬撩竦闹饕?jīng)濟來源之一。高寒藏香豬是世界上高海拔地帶比較少見的小型豬種,亦是我國珍貴的、獨有的豬種。然而,寄生蟲病嚴重威脅著牦牛、藏豬的健康,也制約著牦牛、藏豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,某些人畜共患寄生蟲,更潛在威脅著人類的健康。近年來,牦牛頻發(fā)腹瀉病,至今尚不清楚導致牦牛腹瀉的具體病原。而寄生蟲所致的動物腹瀉病,占所有腹瀉疾病的40%。故為摸清我國珍貴動物(牦牛、藏豬)的常見原蟲流行狀態(tài);初步挖掘牦牛腹瀉的寄生蟲病原體;揭示牦牛、藏豬寄生蟲的分子特征、挖掘潛在的藥物靶基因。本研究開展了牦牛、藏豬常見原蟲的血清學調(diào)查;基于高通量測序的腹瀉牦牛寄生蟲病原調(diào)查;牦牛、藏豬寄生蟲的分子特征研究;藏豬肺線蟲線粒體基因組測序和分析,研究結(jié)果如下:1.我國高原牦牛、藏豬常見原蟲血清學調(diào)查通過IHA或ELISA的檢測方法對在采自我國高海拔地區(qū)的四個省份(西藏、青海、四川、甘肅)的3582份牦牛血清(2011-2017),開展了牦牛七種寄生蟲(弓形蟲、犬新孢子蟲、泰勒蟲、巴貝斯蟲、棘球蚴、貝諾孢子蟲、住肉孢子蟲)的血清學檢測。應用ELISA法對2016年采自西藏地區(qū)的454份藏豬血清進行了棘球蚴血清學檢測。結(jié)果表明牦牛這七種寄生蟲的總體陽性率分別為25.0%、6.3%、15.1%、21.5%、6.5%、1.1%、0.9%;藏豬棘球蚴陽性率為7.3%。2.我國牦牛、藏豬五種寄生蟲線粒體基因擴增及序列分析本研究以在我國西藏地區(qū)某屠宰場收集的藏豬肺線蟲、結(jié)節(jié)線蟲、蛔蟲、包蟲的包囊及在四川紅原地區(qū)采集的牦�；紫x為主要研究對象。通過對寄生蟲蟲體的線粒體分子標記進行基因克隆、序列純化、基因測序。應用生物信息學軟件DNAMAN、Mega等,分別對這五種寄生蟲的9種線粒體基因進行了多序列比對和進化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染我國藏豬的肺線蟲為復陰后圓線蟲,其中米林縣、林芝縣及工布江達縣藏豬源復陰后圓線蟲與澳大利亞野豬源復陰后圓線蟲(NC_013813.1)同源性為97.5%-97.7%。感染藏豬的結(jié)節(jié)線蟲為三種混合感染(齒食道口線蟲、長尾腸結(jié)節(jié)蟲、猩猩管口線蟲)。其中猩猩管口線蟲為首次在豬上發(fā)現(xiàn)。將從藏香豬胃和結(jié)腸分離的猩猩管口線蟲與NCBI數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn),其與猩猩管口線蟲(AJ619979.1)同源性分別為89%和90%�；趎ad1、cox3和ITS三種分子標記基因,發(fā)現(xiàn)藏豬胃、盲腸、結(jié)腸的線蟲陽性率分別為81.13%、66.04%和77.36%。藏豬蛔蟲與豬蛔蟲(日本、我國湛江)分離株的同源性為98.4%-99.9%,與人蛔蟲(日本、巴西、我國臨沭)分離株的同源性為99.4%-99.7%。藏豬包蟲線粒體cox1基因與包蟲G4型(AF346403.11)高度同源,說明感染藏豬的包蟲為G4型。藏豬包蟲線粒體atp6基因與包蟲G6型(AY056613.1)同源性較高,說明感染藏豬的包蟲為包蟲G6型。感染牦牛的蛔蟲為牛弓首蛔蟲,且與牛弓首蛔蟲(AJ937266.1)同源性為99.7%。3.腹瀉牦牛寄生蟲病原調(diào)查本研究從我國甘南地區(qū),采集了健康成年牦牛、腹瀉成年牦牛、腹瀉犢牦牛的糞便樣品,通過提取糞便微生物基因組DNA(g DNA)和進行18S SSU r DNA序列擴增,應用高通量測序法,全面分析了健康成年牦牛、腹瀉成年牦牛、腹瀉犢牦牛的糞便寄生蟲的多樣性與差異性。結(jié)果表明,在門水平上,健康成年牦牛、腹瀉成年牦牛、腹瀉犢牦牛的糞便均檢測到線蟲門和頂復亞門。其中三組牦牛在線蟲門上,無顯著差異性(p0.05);而在頂復亞門上,腹瀉犢牦牛顯著高于腹瀉成年牦牛(p0.05)。在綱水平上,健康成年牦牛、腹瀉成年牦牛、腹瀉犢牦牛的糞便均檢測到側(cè)口綱、色矛綱和Gregarinasina(頂復亞門的一個綱),而僅有腹瀉犢牦牛檢測到旋毛綱和纖毛蟲綱,但健康成年牦牛、腹瀉成年牦牛、腹瀉犢牦牛,在這5種綱水平上均未發(fā)現(xiàn)明顯的差異(p0.05)。在目水平上,健康成年牦牛、腹瀉成年牦牛和腹瀉犢牦牛的糞便均檢測到前庭目、三毛滴蟲目、桿線蟲目和Eugregarinorida(頂復亞門的一個目),而Neogregarinorida(頂復亞門的一個目)、毛滴目和Hypotrichomonadida(鞭毛蟲剛的一類寄生蟲),僅在腹瀉成年牦牛的糞便檢測到。腹瀉成年牦牛在毛滴目上,顯著高于健康成年牦牛(p0.05)和腹瀉犢牦牛(p0.05),而健康成年牦牛、腹瀉成年牦牛、腹瀉犢牦牛,在這其它目水平上均未發(fā)現(xiàn)顯著的差異(p0.05)。在科水平上,健康成年牦牛、腹瀉成年牦牛和腹瀉犢牦牛的糞便均檢測到Simplicimonadidae(毛滴目下的一個科)和Haemonchidae(類毛樣線蟲上科)。而毛圓線蟲科僅在健康成年牦牛和腹瀉成年牦牛糞便檢測到。毛滴蟲科和網(wǎng)尾線蟲科僅在腹瀉成年牦牛糞便檢測到。Plectidae(色矛綱下的一個科)、圓線蟲科、Echinamoebidae(變形蟲門下的一個科)、衣孢蟲科、偽角毛蟲科和Panagrolaimidae(線蟲目下的一個科),僅在腹瀉成年牦牛糞便檢測到,且在毛滴蟲科上,腹瀉成年牦牛顯著高于健康成年牦牛(p0.05)和腹瀉犢牦牛(p0.05)。在屬水平上,健康成年牦牛、腹瀉成年牦牛和腹瀉犢牦牛的糞便均檢測到內(nèi)變形蟲屬、布克斯頓纖毛蟲屬和血矛線蟲屬。而繞線屬和Echinamoeba(變形蟲門下的一個屬),僅在腹瀉成年牦牛的糞便中檢測到。毛圓線蟲屬和錐滴蟲屬,在健康成年牦牛和腹瀉成年牦牛的糞便均檢測到,但腹瀉犢牦牛的糞便未發(fā)現(xiàn)該蟲屬。簇蟲屬僅在腹瀉犢牦牛的糞便檢測出,健康成年牦牛和腹瀉成年牦牛的糞便均未發(fā)現(xiàn)該蟲屬。在四毛滴蟲屬上,腹瀉成年牦牛顯著高于健康成年牦牛(p0.05)和腹瀉犢牦牛(p0.05)。4.急性腹瀉犢牦牛的寄生蟲病原調(diào)查本研究從我國四川某牦牛牧區(qū),采集了健康犢牦牛、急性腹瀉犢牦牛的新鮮糞便樣品。以糞便寄生蟲為研究對象、以18S SSU r DNA為切入點、以高通量測序為載體,全面分析了健康犢牦牛、急性腹瀉血便死亡犢牦牛的糞便寄生蟲的多樣性與差異性,以發(fā)掘潛在的寄生蟲病原體。結(jié)果表明,在門水平上,健康犢牦牛、急性腹瀉便血死亡犢牦牛的糞便均檢測到頂復亞門、槽蟲門、苔蘚蟲門,且健康犢牦牛在槽蟲門上顯著高于腹瀉血便死亡犢牦牛(p0.0001),而在頂復亞門上,腹瀉血便死亡犢牦牛明顯高于健康犢牦牛(p0.0001)。副基體門僅在健康犢牦牛發(fā)現(xiàn),而Blastocysta、變形蟲門僅在腹瀉血便死亡犢牦牛檢出。在綱水平上,健康犢牦牛、腹瀉血便死亡犢牦牛均檢出Trichomonadea、Conoidasida、Phylactolaemata,而健康犢牦牛的Trichomonadea(p0.001)和Conoidasida(p0.0001)均顯著高于腹瀉血便死亡犢牦牛。Archamoebae、Aconoidasida、Blastocystidea這三綱僅在腹瀉血便死亡犢牦牛糞便檢出,而Hypotrichomonadea僅在健康犢牦牛檢出。在目水平上,健康犢牦牛、腹瀉血便死亡犢牦牛的糞便均檢測到Tritrichomonadida、Eugregarinorida和Plumatellida,且Tritrichomonadida、Eugregarinorida在統(tǒng)計學上,健康犢牦牛明顯高于腹瀉血便死亡犢牦牛(p0.0001)。Pelobiontida、Piroplasmida、Blastocystida、Adeleorina這四目僅在腹瀉血便死亡犢牦牛糞便均檢測到,而Hypotrichomonadida僅在健康犢牦牛檢出。在科水平上,健康犢牦牛、腹瀉血便死亡犢牦牛的糞便均檢測到Simplicimonadidae、Gregarinidae和Plumatellidae這3科,且在統(tǒng)計學上,健康犢牦牛的Simplicimonadidae(p0.0001)和Gregarinidae(p0.01)均顯著高于腹瀉血便死亡犢牦牛。Entamoebidae、Theileriidae、Trichomonadidae、Blastocystidae、Cryptosporidae這5科僅在腹瀉血便死亡犢牦牛檢測到,而Hypotrichomonadidae僅在健康犢牦牛檢出。在屬水平上,健康犢牦牛、腹瀉血便死亡犢牦牛的糞便均檢測到Simplicimonas、Gregarina,且健康犢牦牛在這兩屬上均明顯高于腹瀉血便死亡犢牦牛,p值分0.0001和0.01。Entamoeba、Theileria、Tetratrichomonas、Blastocystis、Cryptosporidium這五種屬僅在腹瀉血便死亡犢牦牛的糞便檢出,而Hypotrichomonas僅在健康組犢牦牛的糞便檢測到。5.高原藏豬肺線蟲線粒體基因組分析本研究通過測序,將感染藏豬的肺線蟲鑒定為薩氏肺線蟲(Metastrongylus salmi),并首次揭示了藏豬M.salmi線粒體基因組信息。藏香豬M.salmi的線粒體基因組大小為13722 bp,堿基AT總含量為73.54%,核酸組成為A(23.52%)、C(6.14%)、G(19.60%)、T(50.02%)、N(UCAG)(0.73%)。包含12種蛋白編碼基因(cox1、cox2、cox3、nad1、nad2、nad3、nad4、nad5、nad6、nad4L、atp6、cytb),22個t RNA和2個r RNA(rrn L、rrn S),而缺少編碼atp8蛋白的基因。藏香豬M.salmi線粒體基因組中的nad4L、atp6、nad2、cob、cox3、cox1、cox2、nad5基因的3‘端會緊挨著一個trn堿基序。藏香豬M.salmi線粒體基因組可翻譯氨基酸4237個,其中以ATA為起始密碼子的最多41.7%(5/12);以TAA或TAG為終止密碼子的有11個(91.7%)。藏豬M.salmi線粒體基因使用的密碼子有63種,苯丙氨酸的密碼子UUU的使用頻率最高,而除密碼子CGC外,脯氨酸的密碼子CCC的使用次數(shù)最低。綜上所述本研究闡明了我國珍貴動物(牦牛、藏豬)的七種寄生蟲血清流行病學特點;初步探明了牦牛腹瀉的潛在寄生蟲病原;確定了5種寄生蟲的線粒體基因的分子特征;揭示了藏豬肺線蟲線粒體基因組信息、提供了分子標記和潛在的藥物靶點信息。知己(不斷提高疾病的預防和治療水平等)和知彼(全面掌握寄生蟲的流行狀態(tài)、分子特征等),方能有效的解決我國高原牦牛、藏豬的寄生蟲疾病,為促進我國畜牧業(yè)的蓬勃發(fā)展助力,為減少人畜共患寄生蟲病對牧民的危害提供理論支持。
【圖文】：

圖 1-1 家養(yǎng)牦牛(A)、野牦牛(B)、藏豬(C)Fig 1-1 Domestic yaks, wild yaks, Tibetan pig1.2 牦牛和藏豬的分布牦牛主要分布在高寒、缺氧地帶（ 世界屋脊‖的青藏高原、天山及其周邊山脈）

（圖 1-3）（龔建軍等 2009, Li et al 2016, Li et al 2017）。不同地區(qū)的藏豬，有著不同的地區(qū)性名稱，如甘孜藏豬、西藏藏豬、迪慶藏豬等、蕨麻豬等等（周琳和王蜀金 2014）。由于藏豬有較高的經(jīng)濟價值，發(fā)展藏豬商品化產(chǎn)業(yè)養(yǎng)殖在我國多地區(qū)（包括兩江、兩湖、兩廣、重慶、山東等地）盛行起來，，且發(fā)展良好。關于藏香豬的具體數(shù)目，目前沒有確切的統(tǒng)計。我國西藏有藏種豬大概 3 萬頭、養(yǎng)殖藏豬 40 余萬頭；四川有香豬種豬約 2 萬頭（強巴央宗等 2001）。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.23;S858.28

【參考文獻】

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本文編號：2589230