【摘要】：禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是一種能引起家禽局部或全身性傳染病的細(xì)菌,能與很多病毒性疾病和其他細(xì)菌性疾病并發(fā)。隨著世界集約化養(yǎng)雞行業(yè)的發(fā)展,大腸桿菌病的發(fā)病率和死亡率也逐步升高,給養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展造成了巨大的損失。在大腸桿菌研究中,人們提出了一種新的基因調(diào)節(jié)子,即為非編碼小RNA(small non-coding regulatory RNA,sRNA),其在轉(zhuǎn)錄后可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平,主要參與的調(diào)節(jié)途徑包括轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控、鐵代謝途徑、糖代謝途徑、膜蛋白生物合成、群體感應(yīng)系統(tǒng)以及致病菌的致病力調(diào)節(jié)等。而RyhB也是小RNA的一種,在細(xì)菌致病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵作用。此外,RyhB除了參與調(diào)節(jié)鐵代謝外,在霍亂弧菌和痢疾志賀氏菌中,還發(fā)現(xiàn)RyhB的還能調(diào)控細(xì)菌動(dòng)力、化學(xué)趨化、生物膜、酸性耐受力、氧化還原甚至毒力基因的表達(dá)等。因此,研究RyhB與APEC致病性之間的聯(lián)系,為防控大腸桿菌病提出實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究以實(shí)驗(yàn)室RyhB缺失株為基礎(chǔ),研究RyhB缺失條件下對(duì)細(xì)菌的生物學(xué)特性的影響,并利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較野生株與缺失株差異表達(dá)的蛋白,篩選出影響APEC毒力等相關(guān)特性的相關(guān)靶基因,進(jìn)一步揭示了RyhB與APEC致病力之間的關(guān)系。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:1、sRNA-RyhB對(duì)禽致病性大腸桿菌生物學(xué)特性影響本實(shí)驗(yàn)分別從生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)、組織載菌量實(shí)驗(yàn)、菌體超顯微結(jié)構(gòu)觀察實(shí)驗(yàn)、生物被膜形成能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、LPS完整性實(shí)驗(yàn)、環(huán)境耐受力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)等來(lái)研究禽致病性大腸桿菌RyhB對(duì)細(xì)菌的生物學(xué)特性影響。生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,RyhB沒有影響其生長(zhǎng)性能;組織載菌量實(shí)驗(yàn)表明,注入△RyhB肝臟組織載菌量相比野生株的肝臟組織載菌量降低了6.91倍;超顯微結(jié)構(gòu)觀察實(shí)驗(yàn)表明,同樣的生長(zhǎng)條件下,親本菌AE17有完整的菌毛,而缺失株則沒有完整菌毛;生物膜試驗(yàn)結(jié)果表明,RyhB基因缺失后,生物膜的形成能力減弱,回復(fù)株有所回復(fù),但并沒有回到野生株生物膜形成能力;LPS完整性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RyhB缺失沒有影響有LPS的完整性;環(huán)境耐受力實(shí)驗(yàn)表明,缺失株△RyhB對(duì)氧化不敏感,熱應(yīng)激增強(qiáng),耐酸性增強(qiáng),耐堿性減弱。2、sRNA-RyhB調(diào)控禽致病性大腸桿菌靶蛋白的篩選為探索RyhB可能調(diào)控的毒力基因。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),從蛋白水平比較野生株和缺失株之間差異蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與野生株相比,共發(fā)現(xiàn)62個(gè)差異蛋白。其中Omsc、Galu、Nlpe、Tata、GmhA、proX、inFA、cysE可能是RyhB直接調(diào)控的毒力相關(guān)基因。通過(guò)GO(Gene Ontology)分類結(jié)果顯示,差異表達(dá)蛋白參與的細(xì)胞組分包括細(xì)胞膜、胞外區(qū)、細(xì)胞器、核質(zhì)組成等;分子功能主要表現(xiàn)抗氧化功能、蛋白結(jié)合、催化活性、分子功能調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能等;參與的生物學(xué)過(guò)程主要包括調(diào)控生物調(diào)節(jié)、運(yùn)動(dòng)過(guò)程、新陳代謝過(guò)程、多細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程、應(yīng)激反應(yīng)、單一生物體調(diào)節(jié)過(guò)程等。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)其中10個(gè)差異蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)一致。3、sRNA-RyhB調(diào)控禽致病性大腸桿菌酸性耐受力以及影響生物膜形成靶蛋白分析本實(shí)驗(yàn)基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),篩選得到與酸性耐受力有關(guān)的蛋白,并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)篩選的差異蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè),其結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。在篩選出的差異蛋白的基礎(chǔ)上,結(jié)合在線預(yù)測(cè)軟件篩選可能直接作用的與生物膜形成有關(guān)的靶蛋白。實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了pET28a-cysE表達(dá)載體,獲得可溶性cysE蛋白,用Western Blot檢測(cè)重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物,在蛋白大小約36kDa處有一條蛋白帶,表明表達(dá)產(chǎn)物有良好的特異性。以上研究結(jié)果表明,RyhB的缺失能影響禽致病性大腸桿菌菌毛的表達(dá)并降低肝臟的載菌量、降低生物膜的形成、增強(qiáng)熱應(yīng)激、增強(qiáng)耐酸性、減弱耐堿性。表明RyhB在調(diào)控APEC毒力作用中扮演重要角色,并結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出與生物膜形成、酸性耐受力有關(guān)的蛋白。為后續(xù)研究RyhB調(diào)控靶點(diǎn)奠定了一些基礎(chǔ),同時(shí)也為進(jìn)一步研究APEC的致病作用及宿主抗病機(jī)制提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【圖文】：

圖 1. 生長(zhǎng)曲線測(cè)定Fig1. Determination of growth curve2.1.2 組織載菌量根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,注入相同的劑量細(xì)菌,肝臟組織中 AE17,△RyhB, △RyhB-comp 細(xì)菌分別為 107.49，106.65，107.69，CFU / ml。表明,注入△RyhB 肝臟組織載菌量相比 AE17 的肝臟組織載菌量降低了 6.91 倍。如圖 2 所示

圖 1. 生長(zhǎng)曲線測(cè)定Fig1. Determination of growth curve1.2 組織載菌量根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,注入相同的劑量細(xì)菌,肝臟組織中 AE17,△RyhB, △comp 細(xì)菌分別為 107.49，106.65，107.69，CFU / ml。表明,注入△RyhB 肝臟組菌量相比 AE17 的肝臟組織載菌量降低了 6.91 倍。如圖 2 所示
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.612

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2584904