【摘要】：傳染性支氣管炎(infectious bronchitis, IB)是由傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)引起的急性、高度接觸性傳染病。由于IBV的易變性,不同地區(qū)、不同時(shí)期流行的IBV毒株差異很大。自1996年QX型IBV在我國(guó)首次分離以來(lái),即表現(xiàn)出較強(qiáng)的傳播能力,在許多國(guó)家和地區(qū)流行,目前已成為我國(guó)IBV流行株的優(yōu)勢(shì)基因型。由于不同類型IBV毒株之間只有部分或完全沒(méi)有交叉保護(hù)作用,而我國(guó)目前廣泛使用的Mass型疫苗與QX型毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn),這就導(dǎo)致疫苗免疫失敗的情況時(shí)常發(fā)生,給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,研制與當(dāng)前流行毒株抗原性一致的疫苗對(duì)于IB的防控顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)室前期曾對(duì)QX型IBV CK/CH/JS/2010/12株進(jìn)行了雞胚連續(xù)傳代致弱,并獲得了免疫原性好、遺傳性狀穩(wěn)定的弱毒疫苗株(QXL株)。在臨床試驗(yàn)中,QXL株的安全性和免疫保護(hù)效果良好。本研究對(duì)QXL株的第5代、第40代、第60代、第80代和第100代毒株(QXL-5、QXL-40、QXL-60、QXL-80、QXL-100)進(jìn)行了全基因測(cè)序,并構(gòu)建了QXL-5毒株的反向遺傳系統(tǒng),為了解QX型IBV CK/CH/JS/2010/12株雞胚傳代致弱的分子機(jī)制提供了依據(jù)。1.不同代次IBV CK/CH/JS/2010/12株的全基因序列測(cè)定與分析對(duì)IBV QXL-5、QXL-40、QXL-60、QXL-80、QXL-100的全基因進(jìn)行分段克隆、測(cè)序,并通過(guò)生物學(xué)軟件對(duì)各片段比對(duì)、拼接,獲得各代次毒株的全基因序列。結(jié)果顯示,QXL株基因組結(jié)構(gòu)為5UTR-1a-1b-S-3a-3b-M-ORFX-5a-5b-N-UTR3'。其中QXL-5和QXL-40全長(zhǎng)為27681bp, QXL-60、QXL-80和QXL-100全長(zhǎng)為27682bp,其基因組在ORFX處多出一個(gè)堿基A。對(duì)各代次毒株的全基因序列分析發(fā)現(xiàn),QXL-40、QXL-60基因序列變化較大,分別占?jí)A基總變化數(shù)的28.21%和66.67%,而QXL-80、QXL-100基因序列與QXL-60相比,變化很少,趨于穩(wěn)定。與前期動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果保持一致。在傳代過(guò)程中,QXL-40有44個(gè)堿基發(fā)生變化,并引起23個(gè)氨基酸變化；QXL-60在此基礎(chǔ)上又有108個(gè)堿基發(fā)生變化,并引起31個(gè)氨基酸變化；QXL-80在前面148處變化的基礎(chǔ)上又有2個(gè)堿基發(fā)生變化,引起2個(gè)氨基酸變化；QXL-100在前面150處變化的基礎(chǔ)上又有6個(gè)堿基發(fā)生變化,并引起3個(gè)氨基酸變化。這些突變的氨基酸分散地存在于基因組的不同區(qū)域,其中nsp2變化最大,nsp3和S基因也發(fā)生了較大的變化。分析結(jié)果表明IBV的毒力強(qiáng)弱可能不是由單個(gè)氨基酸的突變引起的,而是由多個(gè)基因共同決定的；同時(shí),其非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)在病毒毒力變化中可能發(fā)揮重要作用。2. IBVQXL-5株反向遺傳平臺(tái)的建立為了進(jìn)一步研究IBV的變異機(jī)理,我們將QXL-5的全基因分成13段進(jìn)行感染性克隆的構(gòu)建。通過(guò)引物在其5'末端引入T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子核心序列,3'末端加上polyA尾巴結(jié)構(gòu),并在ORF5引入一同義突變作為遺傳標(biāo)記。首先將各片段連入pEASY-Blunt載體中進(jìn)行克隆、測(cè)序。然后各測(cè)序正確的片段經(jīng)酶切、體外拼接獲得基因組全長(zhǎng)cDNA分子。同時(shí)獲得N基因全長(zhǎng)cDNA以提高病毒的拯救效率。最后經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄、共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的方法獲得具有感染性的病毒。轉(zhuǎn)染后48h,將細(xì)胞反復(fù)凍融3次接種10日齡SPF雞胚,并盲傳數(shù)代。對(duì)親本毒株QXL-5及盲傳3代的病毒進(jìn)行EID50的測(cè)定。結(jié)果顯示兩者的病毒滴度相似,分別為106.3EID50/0.1mL和106.0EID50/0.1mL。通過(guò)基因測(cè)序?qū)σ氲倪z傳標(biāo)記進(jìn)行鑒定。測(cè)序結(jié)果表明標(biāo)記基因發(fā)生了變化,初步證明成功拯救出了具有感染性的QXL-5病毒,命名為rQXL-5。該反向遺傳平臺(tái)的建立為IBV致病機(jī)制和新型疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖１．ＰＣＲ分段擴(kuò)增全基因電沫因逡逑Ｆｉｇｌ．邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌ校邋ｏｆ邋ＲＴ－ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｃｏｍｐｌｅｔ：ｅ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ逡逑２００ｂｐＭａｒｋｅｒ；邋１？１３分別表示ｒ舊Ｖ－１？ｒ舊Ｖ－１３的ＰＣＲ產(chǎn)物。逡逑邋Ｍ邋ｒｅｐｉ＊ｅｓｅｎｔｓ邋化ｅ邋２００ｂｐ邋ＤＮＡ邋ｌａｄｄｅｒ．邋Ｌａｎｅ邋１邋？１３邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＰＣ民邋ｐｒｏｄ－１邋？ｒ舊邋Ｖ－１３．逡逑．Ｍ邋Ｎ邋Ｇｅｎｅ逡逑…＇．

圖４．全長(zhǎng)ｃＤＮＡ各個(gè)片鐵ＰＣＲ鑒定逡逑Ｆｉ４．邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｅａｃｈ邋ＤＮＡ邋ｆｒａｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ｃｏｍｐｌｅｔｅ邋ｌｅｎｔｈ邋ｃＤＮＡ逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

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2 趙賢衛(wèi);QX公司的經(jīng)銷商—分銷商系統(tǒng)優(yōu)化[D];華中科技大學(xué);2006年

3 陳啟穩(wěn);QX型雞傳染性支氣管炎弱毒疫苗的研制[D];揚(yáng)州大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：2584307