【摘要】：畜牧生產(chǎn)高度集約化,畜禽時(shí)常會(huì)處于非正常環(huán)境條件和非正常生理機(jī)能狀態(tài)下,導(dǎo)致應(yīng)激,從而限制畜禽生長(zhǎng)發(fā)育,降低畜禽生產(chǎn)性能和免疫力,嚴(yán)重時(shí)引起死亡。已有研究表明,在應(yīng)激狀態(tài)下,機(jī)體應(yīng)激激素處于持續(xù)的高水平,進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂,能量代謝失衡。典型例子可見(jiàn)于熱應(yīng)激引發(fā)的胎羊在母體宮內(nèi)發(fā)育遲緩,胎羊體內(nèi)腎上腺素(Epinephrine,Epi)和去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)升高,且伴隨胰島β細(xì)胞分泌胰島素的功能受損,進(jìn)而對(duì)葡萄糖利用能力降低。進(jìn)一步研究表明,對(duì)胎羊持續(xù)注射去甲腎上腺素同樣會(huì)降低胰島素分泌,而移除NE后,發(fā)現(xiàn)葡萄糖刺激下,胰島β細(xì)胞分泌胰島素出現(xiàn)代償性增強(qiáng)。目前由應(yīng)激引起的激素水平升高進(jìn)而改變胰島分泌功能的現(xiàn)象已普遍被認(rèn)可,但仍缺少應(yīng)激激素降低胰島素分泌功能的直接性論證。因此,本研究以體外培養(yǎng)的大鼠原代胰島細(xì)胞為試驗(yàn)材料,探究高濃度Epi對(duì)胰島細(xì)胞分泌功能的作用。試驗(yàn)內(nèi)容主要分為三部分:1、選取濃度為0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1μM、10μM的Epi,在20mM葡萄糖刺激下測(cè)定Epi對(duì)大鼠原代胰島細(xì)胞分泌胰島素的半抑制濃度(IC50),并將其作為后期試驗(yàn)的持續(xù)培養(yǎng)濃度。2、試驗(yàn)組:Epi(IC50)培養(yǎng)3天轉(zhuǎn)移到普通培養(yǎng)液培養(yǎng)2天;對(duì)照組:在普通培養(yǎng)液中培養(yǎng)5天,選取濃度為0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1μM、10μM的Epi,在20 mM葡萄糖刺激下測(cè)定胰島素分泌量(GSIS)及胰島素總量。3、采用常規(guī)PCR與RT-PCR等技術(shù)手段測(cè)定葡萄糖刺激胰島素分泌途徑相關(guān)調(diào)控分子的表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果:1、Epi對(duì)原代胰島細(xì)胞分泌胰島素的半抑制濃度為100 nM。2、胰島素分泌量,試驗(yàn)組與對(duì)照組無(wú)顯著差異,但從分泌曲線中可知,試驗(yàn)組對(duì)應(yīng)的IC50是對(duì)照組的2.9倍(P0.05),顯著升高;試驗(yàn)組胰島素總量高于對(duì)照組42%(P0.05)。3、采用常規(guī)PCR驗(yàn)證GLUT2、腎上腺素受體、G蛋白亞基、Kir6.2、SUR1、CACNA1D、UCP2、PDX-1等調(diào)控信號(hào)分子在胰島細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)模式,結(jié)果表明除α1A-AR,α1B-AR,β3-AR以及Gβ3以外的腎上腺素受體和G蛋白亞基均在胰島細(xì)胞中表達(dá);RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示所有腎上腺素受體在胰島細(xì)胞中表達(dá)無(wú)顯著差異;而G蛋白亞基中Gs,Gz,Gβ1,Gβ2表達(dá)水平顯著降低(P0.05),其他亞基無(wú)顯著差異;此外,UCP2表達(dá)量顯著下調(diào)(P0.05)。根據(jù)以上結(jié)果推測(cè):1、持續(xù)高濃度腎上腺素抑制作用誘導(dǎo)腎上腺素受體脫敏,盡管相關(guān)腎上腺素受體的表達(dá)量未有顯著變化,但試驗(yàn)組的Gβ1、Gβ2表達(dá)量下調(diào)推測(cè)腎上腺素受體發(fā)生磷酸化,受體對(duì)腎上腺素的敏感性降低,表明可能持續(xù)高濃度腎上腺素造成受體脫敏的原因可能是通過(guò)下調(diào)Gβ亞基表達(dá)下調(diào)腎上腺素受體敏感性,而不是通過(guò)減少受體數(shù)量。2、試驗(yàn)組的Gs表達(dá)量下調(diào)表明胞內(nèi)cAMP濃度降低,說(shuō)明持續(xù)腎上腺素抑制作用會(huì)通過(guò)降低G蛋白表達(dá),抑制胰島素分泌。3、試驗(yàn)組的UCP2表達(dá)量下調(diào)說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)ATP合成增多,ATP/ADP比值升高進(jìn)而誘導(dǎo)試驗(yàn)組的胰島素分泌加強(qiáng);但Gz下調(diào)表示其介導(dǎo)的胰島素胞吐作用能力減弱,胰島素顆粒分泌至胞外的含量減少,兩者共同作用造成胞內(nèi)胰島素總量增加。綜上所述,持續(xù)高濃度腎上腺素抑制會(huì)重編程大鼠原代胰島細(xì)胞分泌功能,造成胰島素總量增加,同時(shí)還能誘導(dǎo)腎上腺素受體脫敏。重編程胰島功能的過(guò)程可能與UCP2介導(dǎo)調(diào)控胰島素分泌途徑及G蛋白亞基在胰島素分泌途徑中的功能相關(guān)。
【圖文】：

試驗(yàn)技術(shù)路線圖

入 Cold Quench Buffer 至 30 mL 離心洗滌備用。純化的胰島手挑置于盛有含 10%FBSRPMI1640 的 10cm培% CO2濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng) 18 h 后將胰島細(xì)胞轉(zhuǎn)移至相應(yīng)時(shí)間后，進(jìn)行葡萄糖刺激胰島素分泌試驗(yàn)。糖刺激胰島素分泌分組置于 1.5 mL 凍存管中，每個(gè)管內(nèi) 10 個(gè)胰島細(xì)胞，3 個(gè)糖溶液與胰島細(xì)胞 37℃共培養(yǎng) 1 h，收集上層液，用放射胞分泌量。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察腺經(jīng)膠原酶消化、分離提純后，，可獲得分散較好的胰島細(xì)胞察大鼠原代胰島團(tuán)呈圓形或橢圓形，淡黃色，邊緣有完整光性。大小不一，直徑在 50 ~ 250 μm之間，如圖 3.1 所示
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S852.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2583743