發(fā)布時間：2020-02-29 11:17

【摘要】：畜牧生產高度集約化,畜禽時常會處于非正常環(huán)境條件和非正常生理機能狀態(tài)下,導致應激,從而限制畜禽生長發(fā)育,降低畜禽生產性能和免疫力,嚴重時引起死亡。已有研究表明,在應激狀態(tài)下,機體應激激素處于持續(xù)的高水平,進而導致內分泌系統(tǒng)紊亂,能量代謝失衡。典型例子可見于熱應激引發(fā)的胎羊在母體宮內發(fā)育遲緩,胎羊體內腎上腺素(Epinephrine,Epi)和去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)升高,且伴隨胰島β細胞分泌胰島素的功能受損,進而對葡萄糖利用能力降低。進一步研究表明,對胎羊持續(xù)注射去甲腎上腺素同樣會降低胰島素分泌,而移除NE后,發(fā)現(xiàn)葡萄糖刺激下,胰島β細胞分泌胰島素出現(xiàn)代償性增強。目前由應激引起的激素水平升高進而改變胰島分泌功能的現(xiàn)象已普遍被認可,但仍缺少應激激素降低胰島素分泌功能的直接性論證。因此,本研究以體外培養(yǎng)的大鼠原代胰島細胞為試驗材料,探究高濃度Epi對胰島細胞分泌功能的作用。試驗內容主要分為三部分:1、選取濃度為0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1μM、10μM的Epi,在20mM葡萄糖刺激下測定Epi對大鼠原代胰島細胞分泌胰島素的半抑制濃度(IC50),并將其作為后期試驗的持續(xù)培養(yǎng)濃度。2、試驗組:Epi(IC50)培養(yǎng)3天轉移到普通培養(yǎng)液培養(yǎng)2天;對照組:在普通培養(yǎng)液中培養(yǎng)5天,選取濃度為0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1μM、10μM的Epi,在20 mM葡萄糖刺激下測定胰島素分泌量(GSIS)及胰島素總量。3、采用常規(guī)PCR與RT-PCR等技術手段測定葡萄糖刺激胰島素分泌途徑相關調控分子的表達。本試驗結果:1、Epi對原代胰島細胞分泌胰島素的半抑制濃度為100 nM。2、胰島素分泌量,試驗組與對照組無顯著差異,但從分泌曲線中可知,試驗組對應的IC50是對照組的2.9倍(P0.05),顯著升高;試驗組胰島素總量高于對照組42%(P0.05)。3、采用常規(guī)PCR驗證GLUT2、腎上腺素受體、G蛋白亞基、Kir6.2、SUR1、CACNA1D、UCP2、PDX-1等調控信號分子在胰島細胞內的表達模式,結果表明除α1A-AR,α1B-AR,β3-AR以及Gβ3以外的腎上腺素受體和G蛋白亞基均在胰島細胞中表達;RT-PCR檢測結果顯示所有腎上腺素受體在胰島細胞中表達無顯著差異;而G蛋白亞基中Gs,Gz,Gβ1,Gβ2表達水平顯著降低(P0.05),其他亞基無顯著差異;此外,UCP2表達量顯著下調(P0.05)。根據以上結果推測:1、持續(xù)高濃度腎上腺素抑制作用誘導腎上腺素受體脫敏,盡管相關腎上腺素受體的表達量未有顯著變化,但試驗組的Gβ1、Gβ2表達量下調推測腎上腺素受體發(fā)生磷酸化,受體對腎上腺素的敏感性降低,表明可能持續(xù)高濃度腎上腺素造成受體脫敏的原因可能是通過下調Gβ亞基表達下調腎上腺素受體敏感性,而不是通過減少受體數(shù)量。2、試驗組的Gs表達量下調表明胞內cAMP濃度降低,說明持續(xù)腎上腺素抑制作用會通過降低G蛋白表達,抑制胰島素分泌。3、試驗組的UCP2表達量下調說明細胞內ATP合成增多,ATP/ADP比值升高進而誘導試驗組的胰島素分泌加強;但Gz下調表示其介導的胰島素胞吐作用能力減弱,胰島素顆粒分泌至胞外的含量減少,兩者共同作用造成胞內胰島素總量增加。綜上所述,持續(xù)高濃度腎上腺素抑制會重編程大鼠原代胰島細胞分泌功能,造成胰島素總量增加,同時還能誘導腎上腺素受體脫敏。重編程胰島功能的過程可能與UCP2介導調控胰島素分泌途徑及G蛋白亞基在胰島素分泌途徑中的功能相關。
【圖文】：

試驗技術路線圖

入 Cold Quench Buffer 至 30 mL 離心洗滌備用。純化的胰島手挑置于盛有含 10%FBSRPMI1640 的 10cm培% CO2濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng) 18 h 后將胰島細胞轉移至相應時間后，進行葡萄糖刺激胰島素分泌試驗。糖刺激胰島素分泌分組置于 1.5 mL 凍存管中，每個管內 10 個胰島細胞，3 個糖溶液與胰島細胞 37℃共培養(yǎng) 1 h，收集上層液，用放射胞分泌量。細胞形態(tài)學觀察腺經膠原酶消化、分離提純后，，可獲得分散較好的胰島細胞察大鼠原代胰島團呈圓形或橢圓形，淡黃色，邊緣有完整光性。大小不一，直徑在 50 ~ 250 μm之間，如圖 3.1 所示
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.2

【參考文獻】

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本文編號：2583743