【摘要】：為建立一種用于檢測胞內(nèi)勞森菌的檢測方法,本試驗(yàn)根據(jù)GenBank中公布的胞內(nèi)勞森菌16SrRNA設(shè)計引物建立PCR診斷方法。結(jié)果顯示:獲得了大小為481bp的PCR產(chǎn)物,核苷酸序列同源性分析結(jié)果均為99%以上;特異性試驗(yàn)表明該方法對大腸桿菌、沙門菌、志賀菌、豬流行性腹瀉病毒和金黃色葡萄球菌均為擴(kuò)增陰性;敏感性試驗(yàn)表明該方法的最低檢出量為32.8μg/L;對20份臨床樣品陽性檢出率為15%。結(jié)果表明:該方法具有較好的特異性和敏感性,適用于臨床檢測胞內(nèi)勞森菌。
【圖文】：

，驗(yàn)證該ＰＣＲ方法的特異性。１．７ＰＣＲ敏感性檢測提�。蹋杉�(xì)胞培養(yǎng)物的ＤＮＡ，并采用紫外分光光度計測定其含量。按照１０倍倍比稀釋法進(jìn)行稀釋，分別�。宝蹋谈飨♂尪龋模危聊０暹M(jìn)行ＰＣＲ，以檢測該方法的敏感性。１．８應(yīng)用性檢測應(yīng)用建立的ＰＣＲ方法對２０份疑似患有豬增生性腸炎的病豬糞便樣品進(jìn)行檢測，，以證實(shí)該方法的臨床實(shí)用性。２結(jié)果２．１ＰＣＲ擴(kuò)增及序列測定ＰＣＲ擴(kuò)增獲得大約５００ｂｐ的特異性條帶，與目的條帶大小相近（圖１）。圖１ＬＩＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１．ＬＩ陽性樣品；２．陰性對照將目的條帶送往北京華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序，獲得大小為４８１ｂｐ的核苷酸序列。通過ＤＮＡＳＴＡＲ軟件分析所得序列與ＧｅｎＢａｎｋ上發(fā)表的其他胞內(nèi)勞森菌的１６ＳｒＲＮＡ序列的同源性，結(jié)果顯示該序列與ＧｅｎＢａｎｋ上發(fā)表的其他胞內(nèi)勞森菌的１６ＳｒＲＮＡ一致性均達(dá)到９９％以上（圖２），證明所得片段為胞內(nèi)勞森菌的１６ＳｒＲＮＡ序列。３７中國獸醫(yī)學(xué)報２０１７年１月第３７卷第１期ＣｈｉｎＪＶｅｔＳｃｉＪａｎ．２０１７Ｖｏｌ．３７Ｎｏ．１

圖２同源性比較２．２ＰＣＲ特異性檢測結(jié)果在最適的ＰＣＲ條件下，以ＬＩ陽性樣品和其他對照樣品基因組ＤＮＡ為模板進(jìn)行ＰＣＲ檢測，結(jié)果只有ＬＩ陽性樣品擴(kuò)增出目的條帶，結(jié)果見圖３。圖３ＰＣＲ特異性試驗(yàn)Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１．ＬＩ；２．大腸桿菌；３．沙門菌；４．志賀菌；５．豬流行性腹瀉病毒；６．金黃色葡萄球菌２．３ＰＣＲ敏感性檢測結(jié)果紫外分光光度計測得ＬＩ基因組ＤＮＡ的質(zhì)量濃度為３２８ｍｇ／Ｌ。稀釋質(zhì)量濃度為３．２８×１０－４～３．２８×１０２ｍｇ／Ｌ。經(jīng)ＰＣＲ檢測，３．２８×１０－２～３．２８×１０２ｍｇ／Ｌ質(zhì)量濃度的ＤＮＡ均有條帶，該ＰＣＲ方法能檢測到的最低胞內(nèi)勞森菌的含量為３２．８μｇ／Ｌ（圖４）。２．４應(yīng)用性檢測結(jié)果對疑似豬增生性腸炎的病料進(jìn)行ＰＣＲ檢測，２０份病料中共檢測出３份陽性ＰＣＲ產(chǎn)物，經(jīng)序列測定分析均為胞內(nèi)勞森菌，檢測率為１５％，表明該方法可用于臨床檢測豬增生性腸炎。３討論豬增生性腸炎是由胞內(nèi)勞森菌引起、在各種養(yǎng)殖條件下均可出現(xiàn)的全球性疾玻該病在很多國家和地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，美國、澳大利亞、英國、瑞典、丹麥、韓國、法國和我國等地都有相關(guān)病例的報道［５］。經(jīng)圖４ＰＣＲ敏感性試驗(yàn)Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１．３．２８×１０２ｍｇ／Ｌ的ＬＩ；２．３．２８×１０ｍｇ／Ｌ的ＬＩ；３．３．２８ｍｇ／Ｌ的ＬＩ；４．３．２８×１０－１ｍｇ／Ｌ的ＬＩ；５．３．２８×１０－２ｍｇ／Ｌ的ＬＩ；

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本文編號：2580317