【摘要】：藍舌病(Bluetongue,BT)是由藍舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的一種烈性非接觸性傳染病。BTV屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Obivirus)藍舌病病毒亞群,主要侵害純種細毛羊。該病毒是由10個片段組成的雙股RNA病毒,共編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1~VP7)和5種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3、NS3a、NS4)。其中VP7蛋白攜帶群特異性抗原決定簇,至少含有6個線性抗原表位,通過對不同血清型VP7蛋白的氨基酸序列比對得出,30~48位氨基酸殘基的序列同源性為100%,證明VP7蛋白為高度保守的蛋白,具有群特異性,是BTV抗體檢測的理想抗原。施馬倫貝格病是由施馬倫貝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)引起的經(jīng)庫蠓傳播的一種新型病毒性傳染病。SBV是由3個片段組成的單股負鏈RNA,屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)正布尼亞病毒屬(Orthobunyavirus)辛波血清群病毒(Simbusero group viruses),此病蔓延于西歐大部分地區(qū),我國目前尚未出現(xiàn)此病。在施馬倫貝格病毒編碼的蛋白中,核衣殼N蛋白抗原性最強,因此N蛋白成為研究熱點。本研究為了建立BTV-VP7 ELISA檢測方法,根據(jù)GenBank中BTV 25型毒株的VP7基因序列(登錄號EU839843.1)設(shè)計一對引物,以含VP7基因的重組質(zhì)粒為模板,利用PCR方法擴增出BTV 25型毒株的VP7目的基因,克隆至pET-24b(+)表達載體中,獲得pET-24b-BTV-VP7重組質(zhì)粒。經(jīng)核苷酸序列測定,將正確的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達純化His-BTV-VP7蛋白,以此蛋白作為包被抗原建立間接ELISA檢測方法。經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot鑒定表明,VP7蛋白以包涵體形式表達,分子量大小與預(yù)期相符。ELISA優(yōu)化結(jié)果表明,抗原80倍稀釋、山羊陽性血清400倍稀釋、HRP標記的驢抗山羊IgG 5000倍稀釋為最佳稀釋度。利用該方法與IDEXX藍舌病毒VP7抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果對比,二者一致性超過94%;檢測其他4種病毒陽性血清,結(jié)果均為陰性。說明建立的此法敏感性高、特異性強可以用于藍舌病的流行病學(xué)調(diào)查,且成本低。由于施馬倫貝格病毒是外來病毒,我國尚未出現(xiàn)此病毒株,也沒有出現(xiàn)感染病例,所以本研究為了建立SBV-N ELISA檢測方法,根據(jù)GenBank公布的SBV(BH80/11-4)堿基序列,利用基因合成的方法獲得SBV-N蛋白的基因,克隆至pET-24b(+)表達載體中,獲得pET-24b-SBV-N重組質(zhì)粒。經(jīng)核苷酸序列測定,將正確的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達純化His-SBV-N蛋白。經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot分析得出,重組N蛋白以包涵體形式表達,分子量為26 KD與預(yù)期相符且與單克隆抗體2C8發(fā)生特異性反應(yīng)。用此純化N蛋白作為包被抗原,用其針對的單克隆抗體2C8作為一抗,建立ELISA檢測方法結(jié)果表明,抗原640倍稀釋、一抗100倍稀釋、HRP標記的驢抗鼠IgG 5000倍稀釋為最佳稀釋度,檢測其他4種病毒的陽性血清,結(jié)果均為陰性。證明此方法特異性、敏感性均強,可用來施馬倫貝格病的流行病學(xué)調(diào)查。
【圖文】：

前為止 BTV 是分子量最大的 RNA 病毒[19,20]，基因組約有 19200 43%的 G+C、57%的 A+U 和 5’端（GUUAAA）、3’端（ACU列。末端的保守序列是呼腸孤病毒基因組共同的特點，為轉(zhuǎn)錄提供重要的識別信號[21]。BTV 是由 10 個基因片段組成的雙股碼 7 個結(jié)構(gòu)蛋白（VP1~VP7）和 4 個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NSTV 核酸電泳圖呈現(xiàn)長、中、短三組組成 BTV 病毒的 10 個片段

1.2 BTV 結(jié)構(gòu)蛋白及雙鏈 RNA 基因組的分布結(jié)構(gòu)圖[27] Representative scheme of BTV structural proteins and dsRNA genome[27因組編碼結(jié)構(gòu)蛋白的生物學(xué)功能構(gòu)蛋白 VP3 和 VP7碼的 VP3 蛋白長 901 個氨基酸，，可自我組裝成病毒粒子的早期裝配和復(fù)制過程中起重要作用[28,29]。不但為 VP7 供支架蛋白的作用，形成病毒核心的表層，還裝配由 VP2殼[30]。VP3 自我組裝的能力說明 VP3 的氨基酸序列不僅和折疊，也決定了整個衣殼的結(jié)構(gòu)。同時 VP3 蛋白與三4、VP6 形成的轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物和病毒基因組的相互作用有助結(jié)構(gòu)。在感染細胞中，病毒粒子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)對病毒粒子復(fù) mRNA 的同時合成起到非常重要的作用。Maan S 和 Tanak美國 BTV 10、BTV 17 及澳大利亞 BTV 1 不同血清型的因編碼的 VP3 蛋白高度保守。VP3 的高度保守性決定了 B和作用和抗體的選擇壓力，對 BTV 主要結(jié)構(gòu)和功能的限
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 殷麗霞;;藍舌病的研究現(xiàn)狀[J];吉林畜牧獸醫(yī);2009年05期

本文編號：2576871