【摘要】：【目的】測定一株A型口蹄疫流行毒株的全基因組序列,并構(gòu)建其全長感染性克隆�！痉椒ā繀⒄找压嫉腁型口蹄疫病毒序列設(shè)計引物,將分離的口蹄疫病毒株A/Sea-97/CHA/2014全基因組分為4個重疊的片段進行RT-PCR擴增,并對其進行序列測定與分析。利用酶切連接法將4個基因片段依次克隆至p Blue Script SKhdv載體中,構(gòu)建該流行毒株的全長c DNA克隆p QAHN。pQAHN經(jīng)NotⅠ線性化后轉(zhuǎn)染表達T7 RNA聚合酶的BSR/T7細胞,拯救病毒�！窘Y(jié)果】口蹄疫病毒全基因組序列測定結(jié)果表明該毒株基因組全長8 171 bp[不包括poly(C)區(qū)段和poly(A)尾巴],開放閱讀框為6 996 bp,編碼2 332個氨基酸,5′和3′非編碼區(qū)分別為1 091 bp和95 bp。VP1系統(tǒng)發(fā)生樹分析表明該毒株與A/GDMM/CHA/2013毒株親緣關(guān)系最近,相似性為99.1%。線化全長質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BSR/T7細胞68 h后可觀察到典型的細胞病變。拯救病毒的間接免疫熒光、RT-PCR和序列測定結(jié)果表明成功拯救出了具有感染性的FMDV。拯救病毒與親本病毒的噬斑表型及生長曲線試驗表明二者具有相似的生長表型和增殖能力�！窘Y(jié)論】該研究為我國口蹄疫病原生態(tài)分布、分子流行病學(xué)調(diào)查以及A型FMD新型疫苗的研究提供了有益的材料。
【圖文】：

1個同義突變作為分子標(biāo)記(將基因組第3040位C突變?yōu)锳)，將引入突變后的A3片段和重組質(zhì)粒pSK-A12分別用XbaⅠ/BglⅡ雙酶切消化后，，純化回收相應(yīng)的目的片段，連接、轉(zhuǎn)化和篩選陽性克隆，得到重組質(zhì)粒pSK-A123。最后用BglⅡ/NotⅠ分別消化重組質(zhì)粒pSK-A123和pSK-A4，純化回收相應(yīng)的目的片段，連接、轉(zhuǎn)化和篩選陽性克隆，得到含F(xiàn)MDVA/Sea-97/CHA/2014株全長cDNA的克隆pQAHN。酶切鑒定全長質(zhì)粒pQAHN，并將鑒定正確的全長質(zhì)粒送至上海桑尼有限公司進行測序驗證。A/Sea-97/CHA/2014株基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建策略見圖1。圖1FMDVA/Sea-97/CHA/2014株全長cDNA克隆的構(gòu)建策略Figure1SchematicdiagramofthestrategyforconstructionofFMDVA/Sea-97/CHA/2014full-lengthcDNAclone

2024微生物學(xué)通報Microbiol.China2016,Vol.43,No.9Tel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn編碼一個2332個氨基酸組成的多聚蛋白，其基因組組成見表2。圖2RT-PCR擴增A1、A2、A3、A4片段及A12片段的融合PCRFigure2RT-PCRamplificationofA1,A2,A3,A4fragmentsandFusionPCRamplificationA12fragments注：1：DL10001DNAmarker；2：A1的RT-PCR產(chǎn)物；3：A2的RT-PCR產(chǎn)物；4：A12的融合PCR產(chǎn)物；5：A3的RT-PCR產(chǎn)物；6：A4的RT-PCR產(chǎn)物.Note:1:DL10001DNAmarker;2:RT-PCRproductofA1;3:RT-PCRproductofA2;4:FusionPCRproductsofA12;5:RT-PCRproductofA3;6:RT-PCRproductofA4.利用分子生物學(xué)軟件MegAlign對比分析A/Sea-97/CHA/2014株與其他A型FMDV參考毒株的VP1基因序列，并采用鄰接法(Neighbour-Joining，NJ)繪制系統(tǒng)進化樹(圖3)。分析結(jié)果表明，該流行毒株屬于亞洲拓撲型(Asiatoptype)東南亞97毒株(Sea-97strain)，其與A/GDMM/CHA/2013處于同一分支。核苷酸序列對比結(jié)果表明該流行毒株與A/HUBWH/CHA/2009、A/LAO/1/2006、A/LAO/6/2006和A/LAO/36/2003毒株相似性在90.6%92.5%，與我國歷史毒株AF/72相似性為78.3%，與2013年流行毒株A/GDMM/CHA/2013相似性最高，高達99.1%。2.3全長質(zhì)粒pQAHN的構(gòu)建及鑒定將A/Sea-97/CHA/2014株全基因分4個相互重疊的片段進行RT-PCR擴增，然后將4個片段依次連接到pBlueScriptSKhdv載體上，得到含A/Sea-97/表2FMDVA/Sea-97/CHA/2014基因組結(jié)構(gòu)Table2ThegenomeorganizationofFMDVA/Sea-97/CHA/2014基因組Genome5′-UTRLVP4VP2VP3VP12A2B2C3A3B3C3D3′-UTR核苷酸Nucleotide109160325565466363648447969459213639141095氨基酸Aminoacid2018521822121216149323153712

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本文編號：2572387