【摘要】：大腸埃希菌俗稱大腸桿菌,是一類在自然界中廣泛分布的革蘭陰性菌。根據(jù)其致病性及致病機(jī)理的不同,大腸桿菌被劃分為共生型大腸桿菌(Commensal Escherichia coli)、腸道致病性大腸桿菌(Intestinal pathogenic Escherichia coli,IPEC)以及腸道外致病性大腸桿菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC)。腸道外致病性大腸桿菌是一類機(jī)會(huì)致病菌,長期地?zé)o癥狀地定殖于宿主腸道中。當(dāng)宿主環(huán)境適宜時(shí),能引起宿主的腸道外感染。ExPEC主要包括禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)、致新生兒腦膜炎大腸桿菌(Neonatal meningitis-associated Escherichia coli,NMEC)以及尿道致病性大腸桿菌(Uropathogenic Escherichia coli,UPEC)。APEC可引起多種家禽的急性或慢性感染,導(dǎo)致全身、多組織器官的病變。人源ExPEC可以導(dǎo)致新生兒腦膜炎以及尿道感染。ExPEC潛在的人畜共患性嚴(yán)重威脅人類和動(dòng)物的健康,加強(qiáng)對(duì)ExPEC防控的研究,對(duì)養(yǎng)禽業(yè)和公共衛(wèi)生均具有重要的意義。在ExPEC的防控中目前存在著兩個(gè)難題。首先,依賴于抗生素的防控造成了大腸桿菌耐藥菌株的涌現(xiàn)以及抗生素殘留問題,需要新的替代方法。大腸桿菌血清型眾多,疫苗間交叉保護(hù)力弱,限制了疫苗免疫防控手段的開展。其次,ExPEC的致病機(jī)理不清楚。與IPEC相比,在致病過程中,ExPEC面臨的環(huán)境更加復(fù)雜,需要躲避更多的宿主天然免疫系統(tǒng)的殺傷機(jī)制。目前雖然在ExPEC中鑒定出大量的毒力相關(guān)因子,但是這些毒力因子在致病過程中的作用仍然不是十分清楚。而關(guān)于ExPEC抵抗宿主天然免疫系統(tǒng)的機(jī)制更是知之甚少。本研究一方面試圖通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選ExPEC保護(hù)性抗原,并對(duì)其作為亞單位疫苗的可能性進(jìn)行評(píng)估,另一方面通過轉(zhuǎn)座子突變文庫以及基因缺失技術(shù),研究ExPEC躲避宿主天然免疫系統(tǒng)中溶菌酶殺傷作用的機(jī)制。1.APEC臨床分離株的毒力評(píng)估根據(jù)菌株分離的時(shí)間和地點(diǎn),從2007年～2011年在南京周邊地區(qū)等地分離的467株鴨源APEC臨床分離株中,挑取32株菌株作為代表菌株。通過新生SD大鼠細(xì)菌性腦膜炎模型,對(duì)這些菌株的毒力以及跨血腦屏障的能力進(jìn)行了檢測(cè)。并且利用PCR方法,從種系發(fā)育群和毒力因子分布兩方面對(duì)受測(cè)菌株的分子特性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:各APEC菌株對(duì)新生SD大鼠的致死率從0%～100%不等,菌株間毒力差異較大。其中,有26株菌株能夠從新生SD大鼠的腦脊液中重新分離獲得,說明這些菌株具有穿透血腦屏障的能力。種系發(fā)育群分析發(fā)現(xiàn),所有8株B2群菌株均能跨過血腦屏障,且其中4株菌株對(duì)新生大鼠的致死率接近100%,提示B2群菌株毒力更強(qiáng),更易導(dǎo)致腦膜炎的發(fā)生。在毒力因子分布試驗(yàn)中,僅hlyA未在受測(cè)菌株中擴(kuò)增出目的條帶,其他基因均有分布。Cnf1/2的檢出率最低,在1株不具有穿透血腦屏障的APEC菌株中檢出。GimB和neuC是NMEC重要的毒力因子,檢出率分別為9.375%和12.5%,分布于具有穿透血腦屏障的APEC菌株中,提示它們可能在APEC跨血腦屏障的過程中也發(fā)揮重要的作用。在檢測(cè)的16個(gè)毒力相關(guān)因子中,14個(gè)基因分布于菌株DE205B。該菌株將作為研究APEC免疫保護(hù)性抗原的研究對(duì)象。2.APEC免疫保護(hù)性抗原的篩選及免疫效果的評(píng)價(jià)大腸桿菌血清型眾多,疫苗的交叉保護(hù)力差,成為大腸桿菌疫苗研發(fā)的一個(gè)難題。為了尋找具有交叉保護(hù)力的亞單位疫苗,免疫蛋白質(zhì)組學(xué)以及基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)被運(yùn)用于APEC的免疫保護(hù)性抗原的篩選。提取APEC菌株DE205B(02:K1)的全菌蛋白,經(jīng)二維電泳分離后,與鴨抗DE205B高免血清反應(yīng)。結(jié)果鑒定出14個(gè)具有免疫反應(yīng)性的蛋白點(diǎn),分別代表11個(gè)不同的蛋白,包括外膜蛋白A(OmpA)和鞭毛蛋白(FliC)兩個(gè)已知的免疫原。分子伴侶家族成員GroEL和另外8個(gè)蛋白是首次在APEC中發(fā)現(xiàn)的具有免疫反應(yīng)性的蛋白。通過體外表達(dá)系統(tǒng),成功表達(dá)了9個(gè)基因的重組蛋白。Western blotting結(jié)果顯示,7個(gè)重組蛋白能夠與鴨抗DE205B高免血清反應(yīng),其中重組蛋白GroEL、OmpA和FliC顯示出較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性。攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與已知的免疫原性蛋白OmpA和FliC一樣,重組蛋白GroEL能夠刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生高水平抗體,有一定的交叉免疫保護(hù)力。因此,GroEL可能是一種理想的免疫原,可作為APEC亞單位疫苗的候選對(duì)象。3.NMEC抗溶菌酶相關(guān)基因的篩選及缺失株的構(gòu)建致新生兒腦膜炎大腸桿菌屬于腸道外致病性大腸桿菌,是導(dǎo)致新生兒細(xì)菌性腦膜炎最主要的革蘭陰性致病菌。在致病過程中,NMEC需要躲避宿主的先天免疫系統(tǒng),在宿主的血液中存活并且增殖。溶菌酶是先天免疫系統(tǒng)中重要的防御物質(zhì)之一,廣泛的分布于宿主各組織細(xì)胞中,發(fā)揮著抵抗病原微生物入侵和清除入侵病原菌的作用。近年來雖然多種大腸桿菌溶菌酶抑制因子被發(fā)現(xiàn),但是大腸桿菌逃避溶菌酶介導(dǎo)的殺傷作用的機(jī)制仍然不是十分清楚。因此,本試驗(yàn)利用PUT mini-Tn5 Km質(zhì)粒,構(gòu)建了一個(gè)含有15000個(gè)轉(zhuǎn)座子突變株的突變文庫用以篩選抗溶菌酶菌株NMEC38中與溶菌酶抗性相關(guān)的基因。結(jié)果鑒別出25個(gè)突變株,分別代表20個(gè)基因。其中,14個(gè)基因編碼多種生物合成相關(guān)的酶,包括多糖的合成;1個(gè)基因編碼DctM家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;1個(gè)基因編碼PTS依賴的二羥基丙酮激酶操縱子調(diào)節(jié)蛋白;其余4個(gè)基因編碼多個(gè)假定蛋白,具體功能未知。在這些轉(zhuǎn)座子突變株中,菌株F172對(duì)溶菌酶敏感性最高。對(duì)轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn),包括F172在內(nèi)的9個(gè)菌株(代表6個(gè)基因)的插入位點(diǎn)均位于galF至gnd基因簇之間。利用λred同源重組方法構(gòu)建了galF至gnd基因簇內(nèi)溶菌酶抗性相關(guān)基因的缺失株并進(jìn)行了特性分析,結(jié)果顯示與野生株相比,缺失株對(duì)溶菌酶的抗性均顯著下降,且外膜的通透性也有不同程度的增加。4.NMEC脂多糖抑制溶菌酶活性的鑒定及分析脂多糖是革蘭陰性菌所特有的細(xì)胞壁成份,具有廣泛的生物學(xué)功能。在前期試驗(yàn)篩選獲得的20個(gè)與溶菌酶抗性相關(guān)的基因中,6個(gè)基因位于galF至gnd基因簇。在大腸桿菌中,該基因簇常常與脂多糖O抗原的生物合成有關(guān)。為了研究這些基因在病原菌抗溶菌酶過程中的作用,提取了野生株NMEC38、缺失株和互補(bǔ)株的脂多糖。SDS-PAGE結(jié)果顯示,野生株NMEC38的LPS圖譜呈現(xiàn)多條條帶,以梯級(jí)狀排列;而缺失株LPS圖譜中僅在靠近膠底處出現(xiàn)1～3條條帶,說明缺失株的LPS結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。Western blotting結(jié)果證實(shí)缺失株LPS缺失了O特異性側(cè)鏈多糖部分。溶菌酶抑制試驗(yàn)和凝膠過濾層析試驗(yàn)證實(shí)NMEC38 LPS能夠結(jié)合溶菌酶,抑制溶菌酶活性,協(xié)助病原菌抵抗溶菌酶的殺傷作用。利用酸水解法,進(jìn)一步將野生株LPS裂解為O特異性側(cè)鏈多糖和脂質(zhì)A兩部分。結(jié)合試驗(yàn)證實(shí)不論是側(cè)鏈多糖還是脂質(zhì)A均能與溶菌酶結(jié)合。但是,溶菌酶水解酶活性抑制試驗(yàn)顯示只有O特異性側(cè)鏈多糖能夠抑制溶菌酶水解酶活性,提示脂多糖對(duì)溶菌酶的抑制作用是通過0特異性側(cè)鏈多糖發(fā)揮作用。
【圖文】：

襲微血管上皮細(xì)施；４．穿透血腦屏障；５．誘導(dǎo)宿主肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架血腦屏障后仍保有活力（見圖１－１）。逡逑Ｓｔｅｐｓ邐ＢａｃｔｆｌｒａｆｉｍｉＢ邐；邋Ｂｎｄｎｇ邋Ｉ邐；Ｂｎｄｎｇｌｉ邐；邋（ｎｖａｔｆｏｎ邐；邋Ｃｙｔｏｃｋａｔｏｔａｉ邐；邋ｔｎｒａｃｕＵｏｒ逡逑＊邐？邐ｊ邐＜ｒｏａｒｔａｒｇｖｒｗｎＵ邋？ｓｕｒｖＫｕｌ逡逑；逡逑

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本文編號(hào)：2571124