【摘要】：西尼羅病毒病是由西尼羅病毒(West Nile virus,WNV)感染引起的急性蟲(chóng)媒傳染病,該病可感染鳥(niǎo)類、馬屬動(dòng)物以及人類,引起宿主隱性感染、輕微發(fā)熱、腦脊髓炎、腦炎、甚至死亡等不同程度的臨床癥狀。由于該病長(zhǎng)期威脅著人類健康,給發(fā)病國(guó)家和地區(qū)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失及人員傷亡,已受到世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)和世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties,OIE)的關(guān)注,且位列全球重大流行病榜單。近來(lái)研究顯示:在中國(guó)、韓國(guó)、日本等乙型腦炎病毒流行國(guó)家的鳥(niǎo)體內(nèi)存在WNV抗體。我國(guó)雖然尚未暴發(fā)西尼羅病毒病,但研究者已從新疆地區(qū)的蚊蟲(chóng)體內(nèi)分離得到了WNV病毒,從突發(fā)腦炎和發(fā)燒病人腦脊液中檢測(cè)到了WNV抗體。近年來(lái),西尼羅病毒病不斷在俄羅斯、印度等鄰國(guó)發(fā)生和流行,且隨著國(guó)際間交流及人員往來(lái)的日益頻繁,使得該病在我國(guó)暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)大大增加,必須提高警惕。因此,建立針對(duì)WNV快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)于西尼羅病毒病的診斷、預(yù)防、治療和流行病學(xué)分析具有重要意義。研究目的:建立可用于WNV抗體檢測(cè)的間接ELISA方法、WNV核酸檢測(cè)熒光定量PCR方法和WNV RT-LAMP-VF檢測(cè)方法,為西尼羅病毒病的流行病學(xué)調(diào)查、快速診斷、抗體監(jiān)測(cè)和免疫效果評(píng)價(jià)等提供簡(jiǎn)單、快速、敏感的檢測(cè)技術(shù)和方法。研究?jī)?nèi)容:1.WNV抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用研究。2.WNV核酸檢測(cè)熒光定量PCR方法的建立與評(píng)價(jià)研究。3.WNV RT-LAMP-VF檢測(cè)方法的建立與評(píng)價(jià)研究。研究方法:1.西尼羅病毒抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立構(gòu)建表達(dá)WNV E蛋白第三結(jié)構(gòu)域WNV-E DIII的重組質(zhì)粒p G-EDIII,將之轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DE3菌株進(jìn)行目的蛋白的表達(dá),利用SDS-PAGE電泳及Western blot對(duì)目的蛋白進(jìn)行鑒定,并對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化、透析、濃縮后,-20℃保存?zhèn)溆�。利用純化的目的蛋白作為包被抗原建立WNV抗體間接ELISA檢測(cè)方法,對(duì)ELISA的工作條件進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)優(yōu)化后的方法進(jìn)行特異性、敏感性、重復(fù)性評(píng)價(jià)以及臨床樣品檢測(cè),分析該方法的實(shí)用性。2.西尼羅病毒核酸檢測(cè)熒光定量PCR方法的建立通過(guò)對(duì)不同譜系、不同年代、不同種屬的WNV全基因組序列分析,篩選出WNV全基因組中的保守序列,并以該保守序列為靶位設(shè)計(jì)、合成一對(duì)引物及一條特異性TaqMan探針。以10倍系列稀釋人工合成的rna為標(biāo)準(zhǔn)品,進(jìn)行real-timepcr擴(kuò)增,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立、優(yōu)化方法。并對(duì)優(yōu)化后的方法進(jìn)行特異性、敏感性、重復(fù)性評(píng)價(jià),分析該方法的實(shí)用性。3.西尼羅病毒rt-lamp-vf檢測(cè)方法的建立以不同譜系、不同年代、不同種屬的wnv全基因組的保守區(qū)為靶位,針對(duì)8個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)一套共6條特異性引物,用于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化及擴(kuò)增效率的評(píng)估,建立wnvrt-lamp-vf檢測(cè)方法,對(duì)該方法進(jìn)行特異性、敏感性評(píng)價(jià)以及模擬臨床樣品檢測(cè),分析其實(shí)用性。研究結(jié)果:1.構(gòu)建了表達(dá)wnve蛋白第三結(jié)構(gòu)域蛋白wnv-ediii的重組質(zhì)粒pg-ediii,轉(zhuǎn)化大腸桿菌后目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá),當(dāng)iptg濃度為0.4mm,誘導(dǎo)溫度為37℃,誘導(dǎo)時(shí)間為3h時(shí)該蛋白表達(dá)量最高。利用ni-ntahis親和層析柱進(jìn)行目的蛋白的純化,含250mm咪唑的洗脫液洗脫可得到較純凈的目的蛋白。利用純化后的目的蛋白作為包被抗原建立西尼羅病毒抗體間接elisa檢測(cè)方法。優(yōu)化后的elisa最佳工作條件為:抗原包被濃度為10μg/ml,100μl/孔,4℃包被過(guò)夜;blockingace封閉液37℃封閉1.5h;待檢血清1:80稀釋,37℃孵育1.5h;hrp標(biāo)記的酶標(biāo)二抗1:20,000稀釋,37℃孵育1h。該方法可特異性檢測(cè)西尼羅病毒抗體陽(yáng)性血清,與日本乙型腦炎、委內(nèi)瑞拉馬腦炎、東部馬腦炎、西部馬腦炎抗體陽(yáng)性血清均不發(fā)生交叉反應(yīng)。elisa的批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)均小于7%。用該方法對(duì)25份臨床健康馬匹血清樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明:wnv抗體均為陰性。同時(shí)將優(yōu)化后的elisa方法應(yīng)用于疫苗免疫效果的評(píng)價(jià),并與alpha公司試劑盒進(jìn)行比較,兩者檢測(cè)結(jié)果具有很好的符合率。2.以人工合成的標(biāo)準(zhǔn)品rna為模板,成功建立了西尼羅病毒核酸檢測(cè)熒光定量pcr方法。優(yōu)化后的方法特異性高,在相同條件下不與裂谷熱病毒(rvfv)、埃博拉病毒(ebov)、狂犬病病毒(rabv)、東方馬腦炎病毒(eeev)、西方馬腦炎病毒(weev)相關(guān)基因發(fā)生非特異性擴(kuò)增。批內(nèi)、批間變異系數(shù)小,具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性,敏感度較普通pcr高10倍。3.以人工合成的標(biāo)準(zhǔn)品rna為模板,成功建立了西尼羅病毒rt-lamp-vf檢測(cè)方法。該方法特異性強(qiáng),不與黃病毒科其他成員發(fā)生交叉反應(yīng);且該方法敏感度高,可對(duì)102拷貝數(shù)/μl及以上數(shù)量級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行擴(kuò)增診斷。以表達(dá)wnve蛋白的重組狂犬病病毒rrabv-wnve腦內(nèi)感染icr小鼠,模擬天然活病毒制備臨床樣品,成功將建立的西尼羅病毒rt-lamp-vf核酸檢測(cè)方法應(yīng)用于臨床樣品的檢測(cè),其對(duì)細(xì)胞重組毒的檢測(cè)限(101.5tcid50/ml)與腦組織重組毒的檢測(cè)限(101.33tcid50/ml)相近,無(wú)非特異性擴(kuò)增反應(yīng)的干擾。研究結(jié)論:1.成功表達(dá)并純化了WNV E蛋白第三結(jié)構(gòu)域蛋白WNV-E DIII,并以其作為包被抗原建立了WNV抗體間接ELISA檢測(cè)方法。該方法特異性強(qiáng)、敏感度高、重復(fù)性好,且與商品化的試劑盒檢測(cè)結(jié)果符合率高。2.成功建立了WNV核酸檢測(cè)熒光定量PCR方法。優(yōu)化后的方法特異性強(qiáng)、批內(nèi)及批間變異系數(shù)小,具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性,敏感度較普通PCR高10倍。3.成功建立了西尼羅病毒RT-LAMP-VF檢測(cè)方法。該方法特異性強(qiáng)、敏感度高,在模擬臨床樣品的檢測(cè)中無(wú)非特異性擴(kuò)增反應(yīng)的干擾,具有臨床實(shí)用性。且該方法具有簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn),尤其適用于基層及偏遠(yuǎn)地區(qū)的檢測(cè)任務(wù)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2568611