【摘要】：西尼羅病毒病是由西尼羅病毒(West Nile virus,WNV)感染引起的急性蟲媒傳染病,該病可感染鳥類、馬屬動物以及人類,引起宿主隱性感染、輕微發(fā)熱、腦脊髓炎、腦炎、甚至死亡等不同程度的臨床癥狀。由于該病長期威脅著人類健康,給發(fā)病國家和地區(qū)帶來嚴重的經(jīng)濟損失及人員傷亡,已受到世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)和世界動物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties,OIE)的關注,且位列全球重大流行病榜單。近來研究顯示:在中國、韓國、日本等乙型腦炎病毒流行國家的鳥體內存在WNV抗體。我國雖然尚未暴發(fā)西尼羅病毒病,但研究者已從新疆地區(qū)的蚊蟲體內分離得到了WNV病毒,從突發(fā)腦炎和發(fā)燒病人腦脊液中檢測到了WNV抗體。近年來,西尼羅病毒病不斷在俄羅斯、印度等鄰國發(fā)生和流行,且隨著國際間交流及人員往來的日益頻繁,使得該病在我國暴發(fā)的風險大大增加,必須提高警惕。因此,建立針對WNV快速、靈敏、準確的檢測方法對于西尼羅病毒病的診斷、預防、治療和流行病學分析具有重要意義。研究目的:建立可用于WNV抗體檢測的間接ELISA方法、WNV核酸檢測熒光定量PCR方法和WNV RT-LAMP-VF檢測方法,為西尼羅病毒病的流行病學調查、快速診斷、抗體監(jiān)測和免疫效果評價等提供簡單、快速、敏感的檢測技術和方法。研究內容:1.WNV抗體間接ELISA檢測方法的建立與應用研究。2.WNV核酸檢測熒光定量PCR方法的建立與評價研究。3.WNV RT-LAMP-VF檢測方法的建立與評價研究。研究方法:1.西尼羅病毒抗體間接ELISA檢測方法的建立構建表達WNV E蛋白第三結構域WNV-E DIII的重組質粒p G-EDIII,將之轉化入大腸桿菌DE3菌株進行目的蛋白的表達,利用SDS-PAGE電泳及Western blot對目的蛋白進行鑒定,并對目的蛋白進行純化、透析、濃縮后,-20℃保存?zhèn)溆�。利用純化的目的蛋白作為包被抗原建立WNV抗體間接ELISA檢測方法,對ELISA的工作條件進行優(yōu)化,并對優(yōu)化后的方法進行特異性、敏感性、重復性評價以及臨床樣品檢測,分析該方法的實用性。2.西尼羅病毒核酸檢測熒光定量PCR方法的建立通過對不同譜系、不同年代、不同種屬的WNV全基因組序列分析,篩選出WNV全基因組中的保守序列,并以該保守序列為靶位設計、合成一對引物及一條特異性TaqMan探針。以10倍系列稀釋人工合成的rna為標準品,進行real-timepcr擴增,繪制標準曲線,建立、優(yōu)化方法。并對優(yōu)化后的方法進行特異性、敏感性、重復性評價,分析該方法的實用性。3.西尼羅病毒rt-lamp-vf檢測方法的建立以不同譜系、不同年代、不同種屬的wnv全基因組的保守區(qū)為靶位,針對8個區(qū)域設計一套共6條特異性引物,用于環(huán)介導恒溫擴增反應。通過對反應條件的優(yōu)化及擴增效率的評估,建立wnvrt-lamp-vf檢測方法,對該方法進行特異性、敏感性評價以及模擬臨床樣品檢測,分析其實用性。研究結果:1.構建了表達wnve蛋白第三結構域蛋白wnv-ediii的重組質粒pg-ediii,轉化大腸桿菌后目的蛋白主要以包涵體形式表達,當iptg濃度為0.4mm,誘導溫度為37℃,誘導時間為3h時該蛋白表達量最高。利用ni-ntahis親和層析柱進行目的蛋白的純化,含250mm咪唑的洗脫液洗脫可得到較純凈的目的蛋白。利用純化后的目的蛋白作為包被抗原建立西尼羅病毒抗體間接elisa檢測方法。優(yōu)化后的elisa最佳工作條件為:抗原包被濃度為10μg/ml,100μl/孔,4℃包被過夜;blockingace封閉液37℃封閉1.5h;待檢血清1:80稀釋,37℃孵育1.5h;hrp標記的酶標二抗1:20,000稀釋,37℃孵育1h。該方法可特異性檢測西尼羅病毒抗體陽性血清,與日本乙型腦炎、委內瑞拉馬腦炎、東部馬腦炎、西部馬腦炎抗體陽性血清均不發(fā)生交叉反應。elisa的批內和批間重復試驗變異系數(shù)均小于7%。用該方法對25份臨床健康馬匹血清樣品進行檢測,結果表明:wnv抗體均為陰性。同時將優(yōu)化后的elisa方法應用于疫苗免疫效果的評價,并與alpha公司試劑盒進行比較,兩者檢測結果具有很好的符合率。2.以人工合成的標準品rna為模板,成功建立了西尼羅病毒核酸檢測熒光定量pcr方法。優(yōu)化后的方法特異性高,在相同條件下不與裂谷熱病毒(rvfv)、埃博拉病毒(ebov)、狂犬病病毒(rabv)、東方馬腦炎病毒(eeev)、西方馬腦炎病毒(weev)相關基因發(fā)生非特異性擴增。批內、批間變異系數(shù)小,具有良好的準確性和重復性,敏感度較普通pcr高10倍。3.以人工合成的標準品rna為模板,成功建立了西尼羅病毒rt-lamp-vf檢測方法。該方法特異性強,不與黃病毒科其他成員發(fā)生交叉反應;且該方法敏感度高,可對102拷貝數(shù)/μl及以上數(shù)量級的標準品進行擴增診斷。以表達wnve蛋白的重組狂犬病病毒rrabv-wnve腦內感染icr小鼠,模擬天然活病毒制備臨床樣品,成功將建立的西尼羅病毒rt-lamp-vf核酸檢測方法應用于臨床樣品的檢測,其對細胞重組毒的檢測限(101.5tcid50/ml)與腦組織重組毒的檢測限(101.33tcid50/ml)相近,無非特異性擴增反應的干擾。研究結論:1.成功表達并純化了WNV E蛋白第三結構域蛋白WNV-E DIII,并以其作為包被抗原建立了WNV抗體間接ELISA檢測方法。該方法特異性強、敏感度高、重復性好,且與商品化的試劑盒檢測結果符合率高。2.成功建立了WNV核酸檢測熒光定量PCR方法。優(yōu)化后的方法特異性強、批內及批間變異系數(shù)小,具有良好的準確性和重復性,敏感度較普通PCR高10倍。3.成功建立了西尼羅病毒RT-LAMP-VF檢測方法。該方法特異性強、敏感度高,在模擬臨床樣品的檢測中無非特異性擴增反應的干擾,具有臨床實用性。且該方法具有簡便、快速等優(yōu)點,尤其適用于基層及偏遠地區(qū)的檢測任務。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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