【摘要】：抗葡萄球菌嵌合蛋白P128是由葡萄球菌噬菌體K細(xì)胞壁降解酶活性區(qū)與溶葡萄球菌素細(xì)胞壁結(jié)合區(qū)組成的雜合肽,對(duì)耐藥葡萄球菌具有較強(qiáng)的溶(殺)活性。國(guó)外用大腸桿菌成功表達(dá)了重組P128,但需兩步硫酸銨沉淀和離子交換層析純化。本課題組以類彈性蛋白多肽(Elastin-likepolypeptide,ELP)為純化標(biāo)簽,用腦膜炎奈瑟氏菌FrpC蛋白自加工元件切割ELP標(biāo)簽,但切割效率較低,重復(fù)性較差。煙草蝕紋病毒(Tobacco etch virus,TEV)蛋白酶是該病毒核包涵體蛋白酶的催化活性區(qū),具有識(shí)別序列特異性強(qiáng)、切割活性受目的蛋白氨基酸序列影響小和反應(yīng)兼容性好等優(yōu)點(diǎn)。本課題組研制的自聚肽融合TEV蛋白酶不僅可用離心洗滌法分離純化,而且切割反應(yīng)結(jié)束后能用離心法去除。本研究探索用自聚肽融合TEV蛋白酶切割ELP標(biāo)簽可行性,旨在提高重組P128產(chǎn)量,為相關(guān)基因工程產(chǎn)品開發(fā)打好基礎(chǔ)。用PCR擴(kuò)增P128編碼序列,5'端引入TEV蛋白酶切割位點(diǎn),將PCR產(chǎn)物插入融合表達(dá)載體pELP-Fh8,用重組載體pELP-Fh8-P128轉(zhuǎn)化大腸桿菌,對(duì)IPTG濃度等表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果顯示ELP-Fh8-P128融合蛋白獲得正確表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物為可溶性蛋白。利用溫度敏感相變循化(ITC)純化融合蛋白,對(duì)相變溫度和鹽濃度進(jìn)行了優(yōu)化,經(jīng)兩輪ITC獲得的ELP-Fh8-P128融合蛋白純度達(dá)90%。對(duì)TEV蛋白酶活性包涵體表達(dá)、純化和切割條件進(jìn)行了優(yōu)化,用離心洗滌法獲得了高純度融合蛋白酶。在優(yōu)化條件下切割ELP-Fh8-P128融合蛋白,用ITC去除ELP-Fh8標(biāo)簽,結(jié)果顯示切割效率高達(dá)95%,獲得的重組P128純度達(dá)98%,產(chǎn)量為75mg/L細(xì)菌培養(yǎng)。收集奶牛乳房炎相關(guān)金黃葡萄球菌11株,凝固酶陰性葡萄球菌31株,通過藥敏試驗(yàn)篩選耐頭孢西丁菌株7株,進(jìn)而用重組P128分別進(jìn)行抑(殺)菌試驗(yàn),用MTT法檢測(cè)P128對(duì)牛腎細(xì)胞的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示:除對(duì)1株耐頭孢西丁金黃和沃氏葡萄球菌無效外,重組P128對(duì)9株金黃葡萄球菌的抑菌活性在0.23～0.94μg/ml之間,殺菌活性在0.94～15μg/ml之間;對(duì)6種凝固酶陰性葡萄球菌的抑菌活性在0.12～1.88μg/ml之間,殺菌活性在0.94～30μg/ml之間;對(duì)耐頭孢西丁葡萄球菌的抑(殺)菌活性低于敏感菌株;對(duì)牛腎細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性。
【圖文】：

圖１邋ＥＬＰ的可逆相變逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ｉｎｖｅｒｓｅ邋ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＥＬＰ逡逑重組蛋白純化中的應(yīng)用逡逑研宄發(fā)現(xiàn)不光ＥＬＰ單體具有可逆相變的的特性，與其重組表達(dá)的融合蛋白同

Ｆｉｇ．邋２邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ＩＴＣ邋ｆｏｒ邋ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ逡逑３．邋ＴＥＶ蛋白酶逡逑煙草蝕紋病毒（Ｔｏｂａｃｃｏ邋ｅｔｃｈ邋ｖｉｒｕｓ，ＴＥＶ）是Ｍｍｓｏｎ（１９３０）從感病煙草、番茄、辣椒逡逑和矮牽牛上首次分離到，是馬鈴薯Ｙ病毒重要成員，感染宿主較為廣泛，可以侵染１９科逡逑１２０余種的雙子葉植物１４６］，煙草蝕紋病毒蛋白酶（Ｔｏｂａｃｃｏ邋ｅｔｃｈ邋ｖｉｒｕｓ邋ｐｒｏｔｅａｓｅ，邋ＴＥＶＰ）是逡逑來源于煙草蝕紋病毒（ｔｅｖ）邋Ｎｌａ（核包含蛋白基因）的重組蛋白酶。ＴＥＶＰ是由２４２個(gè)氨基逡逑酸組成的２７ＫＤａ蛋白，因其具有高活性、高度的特異性以及作用條件（如溫度、ＰＨ、離逡逑ｆ強(qiáng)度等）的寬容性等優(yōu)點(diǎn)，所以被廣泛用于切除標(biāo)簽［４７］。與因子Ｘａ，腸肽酶和凝血酶逡逑相比，，沒有關(guān)于ＴＥＶＰ融合蛋白發(fā)生位點(diǎn)錯(cuò)誤切割的報(bào)道。由于在ＴＥＶＰ中三聯(lián)體逡逑（Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｈｉｓ）中的Ｓｅｒ被Ｃｙｓ取代，因此ＴＥＶＰ蛋白酶能夠耐受如ＰＭＳＦ、ＥＤＴＡ、ＡＥＢＳＦ逡逑等多種蛋白抑制劑，而且盡管在低溫中，ＴＥＶＰ也能起到很好的酶切效果。Ｓｉｍ等的研宄逡逑表明即使在較高的變性劑存在時(shí)，ＴＥＶＰ仍能保持其部分活性ＴＥＶＰ與其他酶不同的逡逑一
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.611

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2568124