【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以感染豬發(fā)熱、厭食,妊娠母豬晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎和木乃伊胎,各種年齡豬(特別是仔豬)呼吸障礙為特征的高度傳染性疾病,對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成重大危害,免疫注射活疫苗是預(yù)防該病最有效的方法之一。目前國(guó)內(nèi)外的活疫苗生產(chǎn)主要是采用真空冷凍干燥技術(shù),在2～8℃條件下保存1.5-2年,保存、運(yùn)輸及使用均需要依賴"冷鏈"系統(tǒng)。本研究采用新型梯度真空泡沫干燥方法,研究以海藻糖等為主要成分的PRRS耐熱糖玻璃疫苗,以期獲得更高的耐熱儲(chǔ)存性能,能夠擺脫"冷鏈"依賴的高品質(zhì)疫苗。研究首先對(duì)海藻糖、蔗糖、胰蛋白胨、EDTA、明膠等成分進(jìn)行耐熱配方單因素分析,以37 ℃耐老化試驗(yàn)、殘余水份為篩選指標(biāo),獲得最佳配方;再對(duì)泡沫干燥疫苗的形態(tài)結(jié)構(gòu)、玻璃化轉(zhuǎn)變溫度等進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)化;最后通過保存期和免疫效果確立PRRS耐熱糖玻璃疫苗的實(shí)驗(yàn)室制備工藝,為工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。1.泡沫干燥疫苗保護(hù)劑配方的篩選為了挑選耐熱性能較好的保護(hù)劑,試驗(yàn)選取了蔗糖、海藻糖、明膠、胰蛋白胨等成分,采用單因素設(shè)計(jì)進(jìn)行成分的添加與配伍,在相同的真空干燥程序下,進(jìn)行真空泡沫干燥疫苗的制備。將干燥制品進(jìn)行37 ℃耐老化試驗(yàn),首先發(fā)現(xiàn)T28配方泡沫干燥疫苗10d的耐老化損失低于0.5 Lg,優(yōu)于其他配方。然后在此基礎(chǔ)上繼續(xù)優(yōu)化得到T28C-1、T28C-5、T28C-6、T28C-8配方,制備的泡沫干燥疫苗37 ℃保存10d的耐老化損失Lg值分別是0.43、0.30、0.44和0.38。2.泡沫干燥疫苗制備程序的優(yōu)化泡沫干燥工藝不僅影響疫苗的物理性狀,也影響疫苗制備過程中的效價(jià)損失和耐熱性能。本研究在原有新城疫泡沫干燥工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整,得到初篩結(jié)果較好的T28基礎(chǔ)耐熱配方,能夠穩(wěn)定形成泡沫并保持較低的病毒滴度損失;進(jìn)一步調(diào)整不同的分液量、控制隔板溫度和真空下降速率制備泡沫干燥疫苗,挑選得到T28C耐熱疫苗,并對(duì)不同泡沫形態(tài)的疫苗進(jìn)行物理性狀與耐熱活性比較,發(fā)現(xiàn)不同形態(tài)泡沫干燥疫苗的病毒TCID50差異不大,同一批次泡沫干燥疫苗中形成較膨脹的泡沫、泡沫體積大于瓶高1/2且形態(tài)較為規(guī)則、無沾壁現(xiàn)象的疫苗病毒滴度檢測(cè)Lg值是6.7±0.08;有沾壁現(xiàn)象、泡沫形態(tài)不規(guī)則、雜亂的疫苗病毒滴度檢測(cè)Lg值是6.5±0.11;泡沫未完全膨脹開、聚在瓶底的疫苗病毒滴度檢測(cè)Lg值是6.6±0.07。3.泡沫干燥疫苗理化特性的研究結(jié)合前兩章成功獲得最佳配方和制備工藝,在實(shí)驗(yàn)室試制了幾批PRRS泡沫干燥疫苗,所得到的T28C系列耐熱保護(hù)劑疫苗呈現(xiàn)了致密的乳白色泡沫狀,具有泡沫疏松、高度較為均一(達(dá)到1/2瓶～2/3瓶高)、表面積大有利于水分蒸發(fā)等特點(diǎn),并從微觀上進(jìn)行掃描電鏡的圖片展示;參考《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》相關(guān)方法進(jìn)行了外觀性狀、殘余水分、耐老化試驗(yàn)等測(cè)定,T28C-1、T28C-5、T28C-6和T28C-8配方的殘余水分為2.9%、2.86%、2.94%、2.88%,均低于3%,能夠更好地保存,結(jié)合對(duì)37 10 d的耐老化試驗(yàn)結(jié)果T28C-1、T28C-5、T28C-6和T28C-8配方制備的泡沫干燥疫苗在37 ℃保存10d的耐老化損失Lg值分別是0.43、0.3、0.44、0.38,可以挑選出T28C-5、T28C-6為最佳配方;同時(shí)通過T28C-5、T28C-6配方制備的泡沫干燥疫苗測(cè)定玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg),得到與病毒液配苗后的液體狀態(tài)下分別是-33.68 ℃、-33.82 ℃,經(jīng)泡沫干燥工藝制備的PRRS干燥疫苗分別是56.1 ℃、57.45 ℃,比凍干商品苗的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高12 ℃C。4.泡沫干燥疫苗的質(zhì)量研究為了更好地檢測(cè)泡沫干燥疫苗的耐熱性能,將實(shí)驗(yàn)室制品放置4℃、25℃、37℃和室溫等多種環(huán)境,定期進(jìn)行病毒含量和殘余水分的體外測(cè)定,確定疫苗的保存條件和保存期;同時(shí)進(jìn)行體內(nèi)免疫學(xué)測(cè)定,評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果。結(jié)果表明,T28C-1、T28C-8配方分別在37℃ 80 d、25 ℃ 120 d、自然環(huán)境下保存120 d之后病毒滴度損失均超過1.0 Lg,而采用T28C-5、T28C-6配方制備的PRRS泡沫干燥疫苗在37 ℃保存4個(gè)月,病毒滴度損失1.0 Lg;在25℃保存150天,病毒滴度損失仍然0.8 Lg;在自然環(huán)境下保存150 d病毒滴度損失仍然0.6 Lg。綜合得到T28C-5配方展現(xiàn)出顯著的耐熱性能。進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明,T28C-5泡沫干燥疫苗在37℃、25℃和4 分別保存3個(gè)月后免疫仔豬,免后2周、3周、4周后采血進(jìn)行ELISA測(cè)定�？贵w水平檢測(cè)呈較高的陽性水平,4 ℃保存的泡沫干燥疫苗在免疫后4周的抗體水平能夠達(dá)到商品凍干苗的同等水平。
【圖文】：

圖２－１泡辣干燥一次干燥曲線逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｄｒｙｉｎｇ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ｆｏａｍ邋ｄｒｙｉｎｇ逡逑（４）泡沫干燥疫苗的病毒含量及耐老化的測(cè)定對(duì)培養(yǎng)４８邋ｈ后長(zhǎng)滿的Ｍａｒｃ－１４５逡逑細(xì)胞，經(jīng)膜酶消化并按照１．２５Ｘ１０５個(gè)／ｍｌ的密度鋪９６孔細(xì)胞板，細(xì)胞板在３７邋‘Ｃ和５％逡逑－１

２．１初篩配方的耐老化試驗(yàn)結(jié)果逡逑對(duì)初篩的耐熱保護(hù)劑配方進(jìn)行耐老化測(cè)定，巧’Ｃ保存１０邋ｄ病毒滴度損失在１．０逡逑ＬｇＴＣＩＤｓｏ內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)圖２－２結(jié)果篩選配方作進(jìn)一步研究。逡逑！■邋４邋廠邋Ｔ１邋３逡逑0邋１．２邋－逡逑配方巧朽逡逑圖２－２配方初篩耐老化結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ａｎｔｉ－ａｇｉｎｇ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ邋ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ逡逑Ｔ１３？Ｔ１７幾個(gè)耐熱保護(hù)劑配方所含的糖濃度較高，但耐老化試驗(yàn)的結(jié)果均是疫苗逡逑的耐老化損失大于１．０邋Ｌｇ值，而之后降低糖濃度的耐熱配方反而在耐老化方面有一定逡逑的改善，尤其是Ｔ２８耐熱保護(hù)劑配方，耐老化損失能在０．５邋Ｌｇ左右，在一系列對(duì)成分逡逑調(diào)整的耐熱配方中損失最低，選擇進(jìn)一步優(yōu)化的優(yōu)化調(diào)整。逡逑１６逡逑
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S859.797

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2567367