【摘要】：H5N1 亞型禽流感病毒(Avian influenza viurs H5N1 subtype,AIV H5N1)作為一種高致病性的流感病毒而備受社會(huì)的關(guān)注。目前,在國(guó)內(nèi)外滅活苗一直是防控禽流感的主要手段。但滅活苗免疫效果不理想,不能高效誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫,不能區(qū)分自然感染和疫苗免疫產(chǎn)生的抗體,而且在禽流感滅活苗制備時(shí)有散毒風(fēng)險(xiǎn)。因此,研制安全、高效的新型疫苗已成為當(dāng)務(wù)之急。病毒活載體疫苗能高效表達(dá)病原的保護(hù)性抗原。不僅如此,其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫的同時(shí),亦誘導(dǎo)產(chǎn)生高效細(xì)胞免疫,從而可以達(dá)到有效清除抗原的目的。病毒活載體疫苗已成為當(dāng)前新型疫苗的研究熱點(diǎn)。鴨瘟病毒(Duck enteritis virus,DEV)作為皰疹病毒中的一員,具有較大的基因組結(jié)構(gòu)(基因組大約為158Kbp),而且包含許多生長(zhǎng)非必需的基因序列,這些基因序列的刪除與替換并不影響DEV的生長(zhǎng)特性。而且鴨瘟弱毒疫苗是一種廣泛應(yīng)用的疫苗。由于DEV的上述特性,可作為表達(dá)外源基因的載體病毒。為了使重組DEV活載體疫苗的研制更為簡(jiǎn)便高效,本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了 DEV的細(xì)菌人工染色體(Bacterial Artificial Chromose,BAC),并以之為基礎(chǔ),將合成的帶有pMCMV啟動(dòng)子的HA表達(dá)盒插入DEV BAC的UL55和LORF11之間的非編碼區(qū),構(gòu)建成重組DEV BAC(pDEVC-KCE-H5(UL55))。隨后通過(guò)比較重組BAC(pDEVC-KCE-H5(UL55))與親本BAC(pDEVC-KCE)的基因圖譜進(jìn)行鑒定,結(jié)果與預(yù)期一致。然后,我們將帶有上、下游同源臂且含有g(shù)C基因的片段與pDEVC-KCE-H5(UL55)的DNA通過(guò)共轉(zhuǎn)染CEF的方法成功拯救出恢復(fù)了 gC基因的重組毒——DEV-H5(UL55),并且證明DEV-H5(UL55)的生長(zhǎng)特性與親本毒(DEVC-KCE)無(wú)顯著的差異。將DEV-H5(UL55)接種CEF通過(guò)間接免疫熒光和Western Blotting證明外源基因(HA)能夠穩(wěn)定地表達(dá)。對(duì)構(gòu)建好的重組毒的生物學(xué)特性進(jìn)行相關(guān)的研究及驗(yàn)證后,進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,僅用106 TCID_(50)的DEV-H5(UL55)免疫接種商品鴨就可對(duì)DEV強(qiáng)度攻擊產(chǎn)生100%的免疫保護(hù)。而在免疫3周齡商品蛋雞體內(nèi)亦檢測(cè)到HI滴度,其峰值達(dá)8.2log2。然而當(dāng)對(duì) 1 周齡 SPF 雞接種 106TCID_(50) DEV-H5(UL55)卻導(dǎo)致了 60%(6/10)的死亡率,此外,即使對(duì)商品鴨接種107 TCID_(50)DEV-H5(UL55),其誘導(dǎo)產(chǎn)生的HI效價(jià)也很低。通過(guò)本研究可以得到以下結(jié)論:(1)本實(shí)驗(yàn)中所構(gòu)建的BAC含有DEV vaccine strain C-KCE株的全基因組;(2)HA基因插入到UL55和LORF11之間不會(huì)影響DEVC-KCE的生長(zhǎng)特性;(3)DEV-H5(UL55)能對(duì)鴨瘟產(chǎn)生100%免疫保護(hù);(4)盡管DEV-H5(UL55)對(duì)1周齡SPF雞有一定的毒力,但能誘導(dǎo)3周齡商品雞產(chǎn)生較強(qiáng)的體液反應(yīng);(5)DEV-H5(UL55)誘導(dǎo)商品鴨產(chǎn)生的HI效價(jià)較低。
【圖文】：

圖１－１禽流感病毒的結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇｌ－１邋Ｔｈｅ邋ｓｔｍｃｔｎｉｅ邋ｏｆＡＩＶ邋（Ｆｒｏｍ邋Ｈｕ，邋Ｘ，邋ｅｔ邋ａｌ．２０１１）逡逑凝素糖蛋白，具有紅細(xì)胞凝集的功能，能使驢、馬、豬、生凝集現(xiàn)象。但有趣的是，ＨＡ不能使兔的紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集效

逑位于基因內(nèi)部的重復(fù)序列稱為內(nèi)部重復(fù)序列（Ｉｎｔｅｒｎａｌ邋Ｐｅｐｅａｔｅｄ邋Ｓ巧ｕｅｎｃｅｓ，邋ＩＲＳ）邋口９，逡逑４０］，其基因組結(jié)構(gòu)為ＴＲＳ－ＵＬＩＲＳ－ＵＳ－ＴＲＳ邋（如圖１－２）。逡逑Ｔ民邐ＩＲ邐Ｔ民逡逑■■■邐■■■邐逡逑ＵＬ邐ＵＳ逡逑圖１－２瘡疼病毒的基因組結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇ邋１－２．邋Ｔｈｅ邋ｇｅｎｅｉｋ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｔ邋ｈｃｒｐｅｓｖｉｍｓ逡逑有關(guān)鴨磕序列研究進(jìn)展的報(bào)道較晚，直至１９９８年Ｎｕｍｍｅｒ等首次報(bào)道了邋ＵＬ６和逡逑ＵＬ７的部分基因序列。至此，人們才得Ｗ初步ｒ解鴨磕摘蠟的甚因結(jié)構(gòu)［４Ｕ。韓先杰逡逑等利用ＰＣＲ方法成功擴(kuò)增了完整的鴨磕病毒化、ｇＨ、化２４序列和部分ＵＬ２５、ＵＬ２６逡逑序列［４２］。隨后，陸續(xù)有鴨磕病毒基因組序列被上傳至Ｇｅｎｂａｎｋ中［３Ｗ，如ＵＵ－ＵＬ３５、逡逑ＵＬ４５－ＵＬ５０、ＵＳ１、ＬＯＲＦ３，總共有４５個(gè)基因的ＯＲＦ。直到２００９年，Ｌｉ等首次報(bào)道逡逑了邋ＤＥＶ邋ＶＡＣ強(qiáng)毒株的全基因組序列。２０１１年，Ｗａｎｇ等報(bào)道了歐洲強(qiáng)毒株ＤＥＶ邋２０８５逡逑株全基因組序列［４１，４２］。如今，，鴨磕基因組的研究己日益透徹，除末端巧紐節(jié)列Ｗ及逡逑ＵＳ、ＵＬ區(qū)結(jié)合部位的巧因序列外Ｉ巧他巧列組成己陸續(xù)被發(fā)表，占全益因組的８０％逡逑左右［４０
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2567077