【摘要】：牛結(jié)核病(Bovine tuberculosis)是一種威脅著人類健康、妨礙著畜牧業(yè)發(fā)展的慢性消耗性人畜共患傳染病。牛結(jié)核病的傳染成全球性,發(fā)病沒有明顯的季節(jié)性,宿主十分廣泛牛最易感,人、豬、禽類和野生動物也可患病。人類與牛通過牛的飼養(yǎng)、牛產(chǎn)品的消費(fèi)等多種途徑上密切聯(lián)系著,迫使人類容易感染就結(jié)核病,人類的健康受到嚴(yán)重威脅。目前為止,預(yù)防結(jié)核病的惟一有效的疫苗仍為卡介苗(BCG)。由于BCG的免疫保護(hù)力不斷降低,免疫缺陷疾病病例不斷增加,免疫缺陷的個體不能被BCG保護(hù);而且,BCG免疫容易受環(huán)境中分支桿菌的影響導(dǎo)致失敗。因此,改進(jìn)BCG或研制更為安全高效的新型結(jié)核病疫苗是世界各國著重研究的熱點(diǎn)。Ag85復(fù)合物主要包括Ag85A、Ag85B和Ag85C,是結(jié)核分支桿菌早期的細(xì)胞外分泌性抗原。其中,Ag85A組分是其中分泌率較高的,引起機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答較顯著,是結(jié)核病亞單位疫苗的理想抗原研制;由ag85a構(gòu)建的DNA疫苗可引發(fā)抗結(jié)核免疫應(yīng)答,因此是DNA疫苗的理想候選基因。近年來,ag85a以其優(yōu)秀的免疫原性使得多種攜帶ag85a基因的結(jié)核疫苗已進(jìn)入了臨床試驗(yàn)研究,成效理想。乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)隸屬革蘭氏陽性菌,是一類應(yīng)用在食品中最廣泛的工業(yè)菌株。乳酸菌與人類關(guān)系密切,一些是機(jī)體腸道內(nèi)的正常菌群,對機(jī)體起著有益的作用。在食物腐敗的防治、免疫力的提高以及風(fēng)味的改善等方面乳酸菌起著重要作用。對乳酸菌分子結(jié)構(gòu)、基因組成及其獨(dú)特性質(zhì)的研究不斷深入,除食品工業(yè)外乳酸菌的應(yīng)用領(lǐng)域也逐漸擴(kuò)大。人們以乳酸菌為宿主菌,構(gòu)建用于表達(dá)異源蛋白表達(dá)載體,取得了重大的研究進(jìn)展。由于有些乳酸菌是人和動物腸道的正常菌群,食品級安全乳酸菌載體可以遞呈抗原分子,制成與腸道粘膜直接作用的口服疫苗,可取得良好的免疫效果。本研究通過PCR技術(shù)擴(kuò)增了牛結(jié)核桿菌ag85a基因,并與pMD18-T Sample Vector連接,構(gòu)建了重組克隆質(zhì)粒pMD18-T(S)-ag85a。通過限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和NcoⅠ酶切重組質(zhì)粒pMD18-T(S)-ag85a和乳酸菌表達(dá)載體pNZ8149,將ag85a基因插入pNZ8149表達(dá)載體中,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pNZ8149-ag85a。將重組表達(dá)質(zhì)粒pNZ8149-ag85a電轉(zhuǎn)入宿主菌NZ3900構(gòu)建重組乳酸菌,以獲得攜帶了目的基因Ag85a的重組乳酸菌。經(jīng)10ng/mL Nisin誘導(dǎo),SDS-PAGE分析表明基因成功表達(dá)分子質(zhì)量約為31kDa的蛋白。將此重組乳酸菌飼喂小鼠,研究分析小鼠的免疫應(yīng)答反應(yīng)。為研究重組乳酸菌pNZ8149-ag85a/NZ3900作為牛結(jié)核病新型疫苗奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

18圖 1.1 ag85a 基因的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳Fig.1.1 Result of PCR amplificationM：DL2000 DNA Marker1：ag85a 基因擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化 1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖

圖 1.2 ag85a 基因 PCR 回收產(chǎn)物Fig.1.2 Result of PCR extractionM：DL2000 DNA Marker1：ag85a 基因 PCR 產(chǎn)物回收T Simple Vector 重組質(zhì)粒的提菌 DH5α 感受態(tài)中，，提取質(zhì)
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S855.12

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1 劉鑫;牛分支桿菌ag85a基因重組乳酸菌的構(gòu)建及免疫研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

本文編號：2566305