發(fā)布時間：2019-11-16 06:08

【摘要】：豬瘟病毒(CSFV, Classicsl swine fever virus)是引起豬的高度傳染性致死性疾病——豬瘟的病原。CSFV感染可導(dǎo)致豬嚴(yán)重的白血球減少癥、免疫抑制、廣泛的血栓癥和內(nèi)皮損傷,給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的威脅和經(jīng)濟損失。CSFV是一種小囊膜、單股正鏈RNA病毒,屬于黃病毒科、瘟病毒屬,基因組約12.5 kb,只有1個大的開放閱讀框架(ORF, Open reading frame),所有結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白均由該ORF所編碼,編碼的多聚蛋白約4000個氨基酸殘基,分子量約438 kDa,在細(xì)胞和病毒蛋白酶的加工、修飾下形成12種成熟的病毒蛋白。本研究小組先前的研究證實,在豬瘟病毒感染的過程中IRG6(Inflammatory response gene 6 protein)的mRNA表達(dá)量一直處在非常高的水平。通過NCBI BLAST系統(tǒng)發(fā)現(xiàn),在基因結(jié)構(gòu)上IRG6與其他物種的viperin有非常高的同源性,達(dá)到83.7%,主要功能區(qū)域的同源性達(dá)到90%。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能是密不可分的,IRG6與viperin結(jié)構(gòu)上的高度同源性提示其必然在功能上與viperin有著高度相似性。在感染豬瘟病毒過程中,IRG6的mRNA高水平表達(dá)也說明其與豬瘟病毒感染的密切關(guān)系。本文通過亞克隆的方法以pET-32a(+)原核表達(dá)載體為基礎(chǔ)構(gòu)建了pET-C和pET-NS3原核表達(dá)質(zhì)粒。將pET-C和pET-NS3轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta (DE3)并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),成功獲得重組蛋白C和NS3。通過Ni2+的親和層析法純化了重組蛋白C和NS3,并將以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白NS3進(jìn)行了復(fù)性,制備出可溶性抗原,將重組蛋白C和NS3免疫小鼠制備出抗C蛋白和NS3蛋白蛋白多克隆抗體。Western blot檢測C蛋白和NS3蛋白多克隆抗體,二者能夠分別與重組蛋白C和NS3發(fā)生良好反應(yīng)。進(jìn)一步檢測多克隆抗體的特異性和反應(yīng)性,C蛋白多克隆抗體和NS3蛋白多克隆抗體能與天然構(gòu)象的豬瘟病毒C蛋白和NS3蛋白結(jié)合,兩種抗體的最適稀釋度均達(dá)到1：2000,證明所制備的兩個多克隆抗體具有良好的反應(yīng)性和特異性。運用實時熒光定量PCR技術(shù)、Western blot和IFA檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染peGFP真核表達(dá)載體的PK-15細(xì)胞系、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pIRG6-eGFP真核表達(dá)載體的PK-15細(xì)胞系和PK-15細(xì)胞發(fā)現(xiàn),證實過表達(dá)IRG6蛋白會使豬瘟病毒RNA、病毒蛋白和病毒滴度水平下降,暗示IRG6可能具有抑制豬瘟病毒復(fù)制的生物學(xué)活性。
【圖文】：

３N１Ｃ基因片段的克隆逡逑Ｗ邋ＣＳＦＶ石口株Ｃ基因質(zhì)粒為模板，利用兩對引物ＣＳＦＶ－ＣＦ，ＣＳＦＶ－Ｃ民擴增出長逡逑度為邋２９７ｂｐ的Ｃ基因片段（圖３－ｌ－ｌ），并引入了ＢａｍＨＩ和ＸｈｏＩ兩個酶切位點。將Ｃ逡逑基因片段連接ＰＭＤ１８－Ｔ載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞ＴＯＰ１０、抽提重組質(zhì)粒，命名為ｐＭＤ－Ｃ。逡逑利用６３１１出１和；？0１0１雙酶切鑒定重組質(zhì)粒１）＼征）－（：，如（圖３－１－２），得到約％００郵大逡逑小的質(zhì)粒載體條帶及約２９７邋ｂｐ大小的基因片段條帶，將重組質(zhì)粒送至廣州華大公司測序，逡逑比對確定序列準(zhǔn)確。逡逑Ｍｌ邐Ｍｌ逡逑瞬ＩＨＨ逡逑ＥＳ：邋？■＇ｉｆＳ邐２０００邋ｂｐ邐Ｊ邐ｐＭＤ１８－Ｔ逡逑１；＇邋－ｉ：Ｍ邐心：注ｉｉＳ逡逑５００邋ｂｐ邋—ｆ邐－；例邐ｂｉ邋．邋ｗＭｍ逡逑Ｊ邋如邐ｓｏｏｂｐ—賽逡逑２５0ｂＰ邋—ｔ邐２５0ｂｐ－｜＾ｉｆｌＪ－＂逡逑國邐姦逡逑圖３－１－１邋Ｃ基因片段的ＰＣ民擴增邐W３－１－２重組質(zhì)粒ｐ

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本文編號：2561704