發(fā)布時(shí)間：2019-11-15 06:17

【摘要】：豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是一種急性、高度接觸性豬腸道傳染病,臨床上以仔豬腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征。2010年下半年以來(lái),PED在我國(guó)出現(xiàn)新的暴發(fā)流行,造成哺乳仔豬的大量死亡�，F(xiàn)已成為嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要腹瀉病之一。在我國(guó)現(xiàn)流行的PEDV大多數(shù)為基因2型,其中S基因存在堿基的插入和缺失,與基因1型標(biāo)準(zhǔn)株CV777的同源性?xún)H有85%左右。而我國(guó)傳統(tǒng)的PED疫苗毒株屬于基因1型,對(duì)豬的免疫保護(hù)效果不佳。到目前為止還沒(méi)有一種理想有效的疫苗來(lái)預(yù)防和控制養(yǎng)豬生產(chǎn)中PED的發(fā)生。另一方面,偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)的基因組很大,達(dá)150kb左右,具有宿主范圍廣,不感染人,含有多個(gè)可以缺失的非必需基因,且重組病毒穩(wěn)定等特點(diǎn)。近幾年,隨著豬PRV基因缺失疫苗研制成功,以PRV為載體表達(dá)其他外源蛋白構(gòu)建重組病毒已成為基因工程疫苗的研究熱點(diǎn),其中以PRV-Bac最為突出。開(kāi)展表達(dá)PEDV-S蛋白的重組偽狂犬病毒研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。通過(guò)對(duì)2011-2016年12株浙江省臨床分離的PEDV毒株S和ORF3基因進(jìn)行測(cè)序和分析,結(jié)果表明,12個(gè)樣品株都屬于PEDV的第Ⅰ群,與Genbank中所登錄的近幾年年中國(guó)分離株(BJ-2011和HuN)S基因的氨基酸序列同源性高達(dá)97.8%-99.9%,而與中國(guó)國(guó)內(nèi)疫苗株CV777和韓國(guó)弱毒疫苗株DR13的氨基酸同源性?xún)H在93.3%-94.9%之間。12株樣品株ORF3彼此之間的氨基酸序列同源性為96.9%-100%,其中NB120929、FY140714和HZ150314三個(gè)毒株的S基因氨基酸序列同源性為100%,可以選用其中任何一個(gè)作為流行株。其與疫苗株CV777的同源性為95.6%-96.4%,與中國(guó)分離株BJ-2011的同源性為97.8%-99.6%,與韓國(guó)毒株chinju99和DR13的同源性為96.9%-99.6%。2011-2016年浙江省PEDV的S和ORF3基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系表明,主要為S基因突變。通過(guò)分析S和ORF3基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系,篩選出近年來(lái)浙江省PEDV流行毒株(FY140714),并優(yōu)化流行毒株的S1和S2兩段基因序列,使其適于在真核系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá);通過(guò)Red E/T兩步重組將優(yōu)化后的S1和S2基因分別插入到pPRV-Bac-EF1,構(gòu)建缺失gE和gI基因的pPRV-S1-ΔgIE和pPRV-S2-ΔgIE突變體,用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方法拯救出具有感染性重組病毒,分別命名為rPRV-S1-ΔgIE和rPRV-S2-ΔgIE;在L-阿拉伯糖的誘導(dǎo)下刪除pPRV-S1-ΔgE和pPRV-S2-ΔgE突變體中的Kan基因,再次拯救出rPRV-S1-ΔgIE和rPRV-S2-ΔgIE重組病毒。Western blot結(jié)果表明兩個(gè)重組病毒分別能在BHK-21細(xì)胞內(nèi)表達(dá)S1和S2蛋白;通過(guò)免疫小鼠試驗(yàn),證明rPRV-S1-ΔgIE重組病毒表達(dá)的S1蛋白具有較好的免疫原性,而rPRV-S2-ΔgIE重組病毒表達(dá)的S2蛋白免疫原性較弱。為進(jìn)一步研制PRV和PEDV二聯(lián)重組活載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

且發(fā)病后的臨床表現(xiàn)也極其相似。這兩種病毒粒子具有典型的冠狀病毒形態(tài)：都表現(xiàn)為多形性，大多數(shù)呈球形，直徑在90 nm-190 nm左右，平均直徑為130nm，外部有囊膜包裹，囊膜上有呈放射狀排列的花瓣?duì)罾w突（圖1-2A和1-2B分別展示了PEDV粒子的模式圖和電鏡圖）。而且這兩種病毒的抵抗力均較弱，大多數(shù)消毒藥即可將其殺死，對(duì)乙醇和氯仿等脂溶性溶劑的敏感度較高。在4 ℃，pH 5.0-9.0和37 ℃，pH 6.5-7.5時(shí)病毒的感染力幾乎不會(huì)受到影響，特性比較穩(wěn)定。

.3 PEDV基因組特征PEDV屬于RNA病毒，基因組結(jié)構(gòu)（圖1-3）是單股正鏈RN A PEDV 電鏡圖 B PEDV 結(jié)構(gòu) A Electron microscope pictures of PEDV B The schematic diaAB圖 1-1 PEDV 分類(lèi)地位(摘自國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)第八次報(bào)告g.1-1 Taxonomic status of the PEDV(From The Eighth Report of InternationaTaxonomy of Viruses)
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2561181