【摘要】：根據(jù)大腸桿菌O157的rfbE基因、志賀腸桿菌ipaH基因、單增李斯特桿菌hlyA基因的保守序列,設(shè)計引物和探針,通過優(yōu)化反應(yīng)體系,測定其靈敏度、特異性和重復(fù)性,建立了可同時檢測上述3種食源性致病菌的多重實時熒光PCR方法。試驗結(jié)果顯示,該方法對大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、單增李斯特桿菌進(jìn)行3聯(lián)擴(kuò)增的相對靈敏度檢測限分別為5×10~2、5×10~2和5×10~3CFU/mL;對10株標(biāo)準(zhǔn)/參考菌株的檢測結(jié)果,只有目的菌株呈陽性反應(yīng);用該方法檢測26份凍肉樣品,與傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定法結(jié)果一致,說明研究建立的方法是鑒定3種食源性致病菌的有效方法。
【圖文】：

衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗大腸埃希氏菌0157:H7/NM檢驗、GB4789．5－2012食品微生物學(xué)檢驗志賀氏菌檢驗、GB4789．30－2010食品微生物學(xué)檢驗單核細(xì)胞增生李斯特菌檢驗)進(jìn)行驗證。3結(jié)果與分析3．1三重?zé)晒釶CＲ方法的建立最終建立的反應(yīng)體系為:2×TaqPCＲMasterMix12．5μL，上下游引物各0．5μL(10μmol/L)，探針各0．5μL(10μmol/L)，DNA模板為5μL，補(bǔ)水至25μL。反應(yīng)程序:94℃3min;94℃15s，55℃40s(收集熒光信號)，40個循環(huán)。3．2特異性結(jié)果對抽提的10種細(xì)菌的基因組DNA，利用建立的熒光定量PCＲ體系進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖1。由圖1可知，，建立的檢測方法對大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、單增李斯特桿菌檢測為陽性，其他7株菌株均為陰性，說明該方法具有較好的檢測特異性。圖1三重?zé)晒釶CＲ特異性擴(kuò)增結(jié)果1:大腸桿菌O157擴(kuò)增曲線;2:志賀腸桿菌擴(kuò)增曲線;3:單增李斯特桿菌擴(kuò)增曲線3．3敏感性結(jié)果所建立的三重?zé)晒釶CＲ方法對大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、單增李斯特桿菌進(jìn)行單一擴(kuò)增的相對靈敏度檢測限分別為5×101、5×101和5×103CFU/mL，進(jìn)行三聯(lián)擴(kuò)增的相對靈敏度檢測限分別為5×102、5×102和5×103CFU/mL。具體結(jié)果見圖2。圖2大腸桿菌O157靈敏度擴(kuò)增曲線(從左到右曲線依次5×107－5×101CFU/mL)87

Ｓ賞?可知，建立的檢測方法對大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、單增李斯特桿菌檢測為陽性，其他7株菌株均為陰性，說明該方法具有較好的檢測特異性。圖1三重?zé)晒釶CＲ特異性擴(kuò)增結(jié)果1:大腸桿菌O157擴(kuò)增曲線;2:志賀腸桿菌擴(kuò)增曲線;3:單增李斯特桿菌擴(kuò)增曲線3．3敏感性結(jié)果所建立的三重?zé)晒釶CＲ方法對大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、單增李斯特桿菌進(jìn)行單一擴(kuò)增的相對靈敏度檢測限分別為5×101、5×101和5×103CFU/mL，進(jìn)行三聯(lián)擴(kuò)增的相對靈敏度檢測限分別為5×102、5×102和5×103CFU/mL。具體結(jié)果見圖2。圖2大腸桿菌O157靈敏度擴(kuò)增曲線(從左到右曲線依次5×107－5×101CFU/mL)87

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