【摘要】：血吸蟲(Schistosome)感染人及多種哺乳動物,具有重要公共衛(wèi)生意義。Wnt信號通路是參與調(diào)控胚胎形態(tài)發(fā)育和生長,成體組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)等生物學(xué)過程的保守的信號通路。Wnt蛋白的分泌對Wnt信號通路的開啟具有重要意義,本研究利用Wnt信號蛋白分泌抑制劑及RNA干擾Wnt信號蛋白分泌相關(guān)基因(Porcupine及Wntless)來阻礙Wnt蛋白的分泌,探索Wnt信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制對日本血吸蟲生長發(fā)育及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的影響;同時,對日本血吸蟲Wnt1基因進(jìn)行鑒定。1.日本血吸蟲Wnt分泌相關(guān)蛋白的抑制研究選擇以Porcn為靶點的Wnt信號蛋白分泌抑制劑C59給體外培養(yǎng)血吸蟲添加及給感染血吸蟲的小鼠口服,觀察對體外培養(yǎng)和宿主體內(nèi)生長蟲體的Wnt信號通路的調(diào)節(jié)及產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。利用熒光定量PCR技術(shù)對Wnt信號通路成員基因mRNA水平進(jìn)行比較,確定20 nmol/L為C59的最佳作用濃度;添加C59的第6天,體外培養(yǎng)的14天童蟲的Wnt信號通路開始受到相對持續(xù)的抑制;添加C59的第7天體外培養(yǎng)的7天及14天童蟲作用蟲體的Wnt信號通路受到抑制程度最大;C59對14天童蟲Wnt信號通路的抑制效果要比7天童蟲更明顯。熒光定量PCR分析,結(jié)果顯示C59處理的7天童蟲及14天童蟲的促凋亡相關(guān)因子及DNA損傷相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度的上調(diào),且14天蟲體這些基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)的程度更大,推測是Wnt信號通路的抑制程度越大,細(xì)胞就更趨于凋亡。體外培養(yǎng)的14天蟲體的掃描電鏡結(jié)果顯示:C59組蟲體與DMSO組及空白對照組相比,體表結(jié)構(gòu)沒有明顯差別,表明C59的添加未對蟲體的體被屏障產(chǎn)生直接的刺激和損傷。透射電鏡結(jié)果顯示:C59組蟲體超微結(jié)構(gòu)模糊不清,腸腔上皮脫落,腸管微絨毛較少、斷裂等變化,推測是由于Wnt信號通路的抑制導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境不能維持穩(wěn)定,引起細(xì)胞凋亡甚至壞死,這與C59組凋亡相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)的結(jié)果吻合。C59作用于體內(nèi)寄生的日本血吸蟲的研究結(jié)果顯示,可引起蟲體大部分Wnt信號通路成員轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),其中Wnt/β-catenin信號通路的成員基因及Wnt/Ca2+信號通路成員基因下調(diào)程度相對較大,推測童蟲階段Wnt/β-catenin信號通路及Wnt/Ca2+信號通路的調(diào)節(jié)功能活躍;C59可用于對宿主體內(nèi)蟲體Wnt信號通路的抑制實驗。通過Race技術(shù)獲得SjPorcn蛋白基因的全序列;其編碼的氨基酸序列存在三個高度保守的氨基酸殘基;利用RNA干擾SjPorcn,使其表達(dá)下調(diào),也可引起類似C59對蟲體Wnt信號通路產(chǎn)生的作用,導(dǎo)致Wnt/β-catenin、Wnt/PCP及Wnt/Ca2+信號通路不同程度的抑制�？寺¤b定了日本血吸蟲的Wntless基因(SjWls)。序列分析顯示,SjWls氨基酸序列羧基末端為KEAFE并有一個保守的賴氨酸殘基,該序列可能與SjWls的亞細(xì)胞定位相關(guān)。SjWls蛋白在蟲體的組織定位分析,結(jié)果顯示SjWls蛋白廣泛分布于蟲體吸盤、抱雌溝及生殖器官等組織中,表明Wls蛋白在各個組織中都有分布。利用RNA干擾SjWls,使其表達(dá)下調(diào)可以引起Wnt/β-catenin、Wnt/PCP及Wnt/Ca2+信號通路不同程度的抑制。2.日本血吸蟲Wnt1基因鑒定及在不同發(fā)育階段表達(dá)水平分析克隆鑒定了日本血吸蟲的Wnt1基因(SjWnt1)。序列分析顯示,SjWnt1蛋白有Wnt信號蛋白家族的結(jié)構(gòu)功能域,但比高等生物的Wnt1少一個保守的Cys。mRNA和蛋白的定量分析結(jié)果顯示,SjWnt1表達(dá)于血吸蟲的整個發(fā)育過程,而在蟲卵和早期童蟲中呈高表達(dá)水平,提示SjWnt1對卵胚發(fā)育和早期童蟲的細(xì)胞分化具有調(diào)節(jié)作用。來源于非適宜宿主及單性感染的發(fā)育不良蟲體中SjWnt1 mRNA水平比發(fā)育正常的蟲體高,表明不良發(fā)育的蟲體相應(yīng)的Wnt信號阻滯。SjWnt1表達(dá)下調(diào)后則引起Wnt/β-catenin、Wnt/PCP及Wnt/Ca2+通路的相應(yīng)下游基因的mRNA水平下降,推測SjWnt1可能通過這3種傳遞途徑行使信號傳遞的功能。本文開展了日本血吸蟲Wnt分泌相關(guān)基因的抑制研究。確定了Porcn蛋白的專性抑制物C59的最佳作用濃度及時效,并分析了C59對體、內(nèi)外童蟲Wnt信號通路的抑制效果。篩選出兩個Wnt蛋白分泌相關(guān)基因:Porcn及Wls的siRNA,并分析了Porcn及Wls基因下調(diào)對Wnt信號通路的抑制效果。為從整體上抑制血吸蟲的Wnt家族蛋白,探討該通路對血吸蟲生長發(fā)育調(diào)控的分子機制建立了實驗方法。另外,在前期研究工作的基礎(chǔ)上,對SjWnt1進(jìn)行了鑒定和分析,為認(rèn)識SjWnt1在血吸蟲發(fā)育中的調(diào)節(jié)功能提供實驗基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 信彩巖;王孝波;馮新港;高陽;石耀軍;楊健美;王立群;苑純秀;;日本血吸蟲Wnt受體蛋白SjFz5在不同發(fā)育階段的組織定位及mRNA表達(dá)水平分析[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;2012年08期

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本文編號：2560630