【摘要】：玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEA)是存在于谷物、啤酒、牛奶等食品中的類雌激素霉菌毒素,可嚴重影響動物及人類的健康。研究發(fā)現(xiàn)ZEA不僅具有生殖毒性、肝毒性、遺傳毒性、免疫毒性,還可引起動物睪丸間質(zhì)腫瘤的發(fā)生,但關(guān)于ZEA誘發(fā)睪丸間質(zhì)腫瘤的機制目前尚不明確。本實驗以小鼠睪丸間質(zhì)細胞(TM3細胞)為材料,研究了低濃度的ZEA暴露對TM3細胞的細胞增殖活力、細胞凋亡、細胞周期及其相關(guān)調(diào)控蛋白的影響,DNA損傷及原癌、抑癌基因的影響,細胞間隙連接通訊及其連接蛋白的影響,以揭示ZEA誘發(fā)睪丸間質(zhì)腫瘤的機制。主要研究內(nèi)容如下：1.ZEA對TM3細胞增殖、細胞周期及凋亡的影響。不同濃度的ZEA(0、5、10、20μg/L),染毒TM3細胞72h,應用MTT法檢測ZEA染毒后對TM3細胞增殖活力的影響；AnnexinV-FITC/PI雙熒光染料對細胞進行染色,流式細胞儀檢測ZEA染毒TM3細胞凋亡情況,同時通過PI熒光染色法檢測細胞周期的變化；通過免疫印跡法(Western Blot)檢測凋亡調(diào)控蛋白Cyclin D1及其激酶Cdk4, Bcl-2基因家族成員的表達情況。結(jié)果顯示,低濃度ZEA對TM3細胞的增殖具有促進作用,且存在劑量-效應關(guān)系,在ZEA染毒濃度為20μg/L時,TM3細胞的相對增殖活力明顯提高(P0.05); ZEA染毒后,分布于G1/G0期的TM3細胞量逐漸減少,開始向S期和G2期進行轉(zhuǎn)化,而細胞周期調(diào)控蛋白Cyclin D1及其激酶Cdk4蛋白表達量隨ZEA染毒濃度的升高而呈上升趨勢；細胞凋亡檢測結(jié)果顯示,10、20μg/L ZEA染毒后TM3細胞的凋亡率極顯著下降(P0.01),但20μg/L ZEA染毒組較10μg/L ZEA染毒組凋亡率略有上升(P0.05)；與對照組比較,各染毒組凋亡調(diào)控蛋白Bax/Bcl-2灰度值比值均顯著降低(P0.05)。2.ZEA對TM3細胞DNA損傷及原癌、抑癌基因的調(diào)控作用。ZEA染毒TM3細胞72h,應用Western Blot檢測磷酸化組蛋白yH2AX的蛋白表達水平,同時檢測原癌基因c-Myc、c-Fos、c-Jun,抑癌基因p53、PTEN的蛋白表達水平：免疫熒光法檢測yH2AX滅光焦點的形成情況。結(jié)果顯示,TM3細胞內(nèi)形成的yH2AX熒光焦點數(shù)量及形成熒光焦點的細胞數(shù)量都隨著ZEA染毒濃度的升高而增加,20μg/L ZEA染毒組只有26.21%的細胞未形成熒光焦點,其余細胞均有不同程度的DNA損傷；與對照組比較,各染毒組yH2AX蛋白表達量均顯著升高(P0.05)；隨著ZEA染毒濃度的升高,原癌基因c-Myc、c-Fo c-Jun蛋白表達水平呈上升趨勢,各染毒組與對照組比較均有顯著差異(P0.05),相反抑癌基因p53及PTEN蛋白表達水平則呈下降趨勢,且差異極顯著(P0.01)。3.ZEA對TM3細胞間隙連接通訊及其連接蛋白的影響。ZEA染毒TM3細胞72h。Western Blot檢測細胞間隙連接蛋白Cx32、Cx43的蛋白表達水平；FITC熒光染料染色Cx43,在熒光顯微鏡下觀察Cx43在細胞內(nèi)的分布情況；劃痕標記染料示蹤技術(shù)(SLDT法)檢測TM3細胞暴露于ZEA后,相鄰細胞之間GJIC功能的變化。結(jié)果顯示,隨著ZEA染毒濃度的升高,TM3細胞連接蛋白Cx32、Cx43的表達量呈下降趨勢,各染毒組與對照組比較均有顯著差異(P0.05)；熒光顯微鏡下觀察到Cx43在正常細胞內(nèi)呈現(xiàn)點線狀結(jié)構(gòu)分布于細胞膜周圍,然而在ZEA染毒后Cx43原有的點線狀結(jié)構(gòu)遭受破壞,熒光強度減弱,其分布逐漸趨向于細胞質(zhì)和細胞核膜上；SLDT技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)小分子染料熒光黃(LY)在相鄰細胞間的擴散距離隨著ZEA染毒濃度的升高而呈現(xiàn)縮短趨勢,10μg/L ZEA以上染毒組均較對照組有極顯著差異(P0.01),表明GJIC功能受到了ZEA的抑制。結(jié)論認為,低劑量ZEA可引起TM3細胞DNA的損傷,同時伴隨原癌、抑癌基因及凋亡調(diào)控蛋白Bal-2、Bax表達的異常及細胞間隙連接通訊的抑制,這些被認為是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵機制。ZEA可導致TM3細胞基因組穩(wěn)定性降低,其生長調(diào)控機制的平衡狀態(tài)遭受破壞,細胞增殖、分化發(fā)生異常變化,若細胞的持續(xù)增殖及惡性轉(zhuǎn)化未及時受到抑制,最終可導致腫瘤的發(fā)生。
【圖文】：

進行了統(tǒng)計和研究，發(fā)現(xiàn)除甲狀腺癌受遺傳因素影響較大外，其余１４種最常見的癌癥的逡逑發(fā)生主要受到環(huán)境因素的影響這與日益嚴重的空氣、止地、水源及食品污染密不可分。逡逑如圖１－２所示，Ｈａｎａｈａｎ在報道中提出了癌癥的六大特征，包括誘導血管生成，避免細胞逡逑死亡，避免細胞生長受到抑制，持續(xù)的細胞增殖信號，侵襲和轉(zhuǎn)移的激活Ｗ及細胞無限增逡逑值的潛能ｔＷ。微環(huán)境的變化與信號之間的相互作用是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵。逡逑邐ｍｍａｍ逡逑圖１－２邋癌癥發(fā)生的六大信號（引自Ｈａｎａｈａｎ邋Ｄ邋ａｎｄ邋Ｗｅｉｎｂｅｒｇ邋Ｒ．邋Ｃｅｌｌｓ邋２０００；邋１００（１）：邋５７－７０．）逡逑‘，

本文編號：2559021