【摘要】：豬丁型冠狀病毒(PDCoV)是2014年檢測(cè)出的一種新型豬源腸道冠狀病毒,對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為建立快速檢測(cè)PDCoV的血清學(xué)方法,本研究以原核表達(dá)的PDCoVN重組蛋白為包被抗原,通過(guò)反應(yīng)條件優(yōu)化,建立了一種PDCoV重組N蛋白的間接ELISA抗體檢測(cè)方法。結(jié)果顯示,原核表達(dá)的PDCoV重組N蛋白約為28ku,westernblot證實(shí)表達(dá)蛋白具有良好的反應(yīng)原性;以其作為包被抗原建立的PDCoV抗體間接ELISA方法僅對(duì)PDCoV血清檢測(cè)為陽(yáng)性,與豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒等7種主要豬源病毒陽(yáng)性血清均無(wú)特異性反應(yīng),具有良好的特異性。該方法檢測(cè)靈敏度較高、重復(fù)性好,批內(nèi)和批間重復(fù)性變異系數(shù)均小于10%;采用該ELISA方法對(duì)我國(guó)2014年~2016年間采集的不同地區(qū)豬場(chǎng)的100份臨床血清樣品進(jìn)行了檢測(cè),陽(yáng)性率高于45.9%,表明我國(guó)豬群中存在PDCoV感染。本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA方法可以用于檢測(cè)臨床樣品中的PDCoV抗體,是PDCoV流行病學(xué)調(diào)查的一種有效工具,對(duì)該病的防控具有重要意義。
【圖文】：

M:ProteinMarker;1:Totalbacteria;2:Supernatant;3:Precipitate;4-6:Purifiedprotein圖1重組N蛋白表達(dá)的鑒定Fig.1IdentificationofrecombinantNproteinexpressionwesternblot鑒定。1.6間接ELISA方法的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化將純化的重組蛋白作為抗原用包被液依次做1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀釋，按100μL/孔滴加到聚苯乙烯微量滴定板中，4℃包被過(guò)夜。棄液，PBST洗3次，200μL/孔，每次3min～5min。用5%脫脂乳(PBST稀釋)按200μL/孔的量封閉1h，棄去封閉液后按上述方法洗滌。將PDCoV陰陽(yáng)性血清分別依次做1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160稀釋(2%脫脂乳稀釋)，組成方陣，100μL/孔，37℃作用1h，，棄液后按上述方法洗滌，加入1∶10000稀釋(2%脫脂乳稀釋)的羊抗豬lgG-HRP，100μL/孔，37℃作用1h，棄液，按上述方法洗滌，加入單組分TMB顯色液，100μL/孔，室溫避光顯色10min，加入終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取OD450nm值。比較陰陽(yáng)性血清的OD450nm值，選取陽(yáng)性血清OD450nm值為1.0左右，陰性O(shè)D450nm值為0.2以下，且陽(yáng)性與陰性O(shè)D450nm比值(P/N)最大時(shí)的抗原包被濃度為抗原最佳包被濃度，對(duì)應(yīng)的陰陽(yáng)性血清稀釋度為血清最佳稀釋度。同時(shí)對(duì)抗原包被時(shí)間、封閉液的選擇及作用時(shí)間、最佳一抗作用時(shí)間、酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)和作用時(shí)間、底物顯色時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化。1.7陰陽(yáng)性臨界值的確定按最適抗原包被濃度包被ELISA板，按優(yōu)化后的間接ELISA方法篩選臨床血清，選取其中OD450nm值<0.3的血清72份，計(jì)算S/P值，S/P值=(樣品血清OD450nm值-陰性血清OD450nm值)/(陽(yáng)性血清OD450nm值-陰性血清OD450nm值)，計(jì)算各血清S/P值的平均值X及標(biāo)準(zhǔn)方差SD，當(dāng)樣品S/P值<X+2SD時(shí)，判為陰性；樣品S/P值>X+

?5.95%(17/37)，可見(jiàn)2014年～2016年間血清樣品的陽(yáng)性率均在50%左右，陽(yáng)性率較高(表5)。表1間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化Table1Theoptimizationofindirect-ELISA最佳稀釋度Optimizeddilutions反應(yīng)條件ReactingConditions重組N蛋白為包被抗原CoatedwithrecombinantNprotein1:80(0.466μg/100μL)4℃/12h+37℃/60min5%skimmilk37℃/60min待檢樣品Untestedsamples1:4037℃/30min羊抗豬lgG-HRPGoatAnti-piglgG-HRP1:1000037℃/30min顯色時(shí)間Colorreactiontime10min圖2陰性樣品OD450nm結(jié)果正態(tài)分布圖Fig.2TheOD450nmvaluesofnegativesamples'normaldistributiondiagram表2ELISA特異性試驗(yàn)結(jié)果Table2ThespecificitytestofIndirectELISA血清SerumX(OD450nm)S/P結(jié)果判定ResultsCSFV0.098-0.066-PRRSV0.093-0.07-PRV0.094-0.069-FMDV0.2390.042-PCV20.114-0.054-PEDV0.2940.085-TGEV0.410.174-+1.484-0.184表3ELISA敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table3ThesusceptibilitytestofIndirectELISA陽(yáng)性血清Positiveserums1231∶401.5371.5101.0961∶800.7440.7080.5941∶1600.4140.4060.3441∶3200.3100.2200.1611∶6400.0880.0880.0151∶12800.000-0.016-0.0281∶2560-0.041-0.062-0.059血清稀釋度Serumdilutions表4間接ELISA重復(fù)性試驗(yàn)(n=8)Table4RepeatabilityassayforindirectELISA(n=8）血清編號(hào)Serumnumbers12345678平均數(shù)X±SD0.423±0.030.86±0.0370.563±0.0530.652±0.0570.719±0.0021.026±0.0280.156±0.0

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