【摘要】：降低胚胎內(nèi)源性原始生殖細(xì)胞是提高禽類生殖嵌合體效率的最有效途徑,本試驗首次研究白消安對鵝胚內(nèi)源性原始生殖細(xì)胞的消減作用。將白消安乳化劑直接注射到鵝種蛋的卵黃內(nèi),待鵝胚發(fā)育到第8 d時分離生殖腺中的PGCs,并統(tǒng)計PGCs數(shù)目。結(jié)果顯示,糖原染色與免疫熒光染色充分證明從鵝胚生殖腺中成功分離到PGCs;較低濃度(每1顆卵注射150μg)的白消安能顯著降低鵝胚內(nèi)源性原始生殖細(xì)胞,從對照的單胚約1 200個PGCs降低到處理組的80個左右。鵝相對于雞而言對白消安更敏感,較低濃度即可顯著降低鵝內(nèi)源性PGCs。
【圖文】：

豢?∶100稀釋，4℃過夜孵育，PBS-T清洗后，二抗1∶1000稀釋，37℃避光孵育1h，將Hoechst33342用PBS稀釋1000倍至10μg/ml，加入到PGCs中，避光染色2min，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。1．5數(shù)據(jù)分析每個處理采集15個鵝胚的數(shù)據(jù)，采用SPSS11．0中ANOVA進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計學(xué)分析，顯著性差異以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)。統(tǒng)計作圖采用SigmaPlot繪圖軟件。2結(jié)果2．1鵝胚PGCs的形態(tài)觀察將每只鵝胚分離的左右兩側(cè)生殖腺進(jìn)行胰酶-EDTA消化，放到24孔培養(yǎng)板體外培養(yǎng)4h，收集培養(yǎng)液，于顯微鏡下進(jìn)行觀察�？梢妱傁蟮募�(xì)胞中雜細(xì)胞很多(圖1A)，體外培養(yǎng)4h后大多數(shù)雜細(xì)胞貼壁(圖1B)，而鵝胚PGCs不貼壁，由此將鵝胚PGCs與其他細(xì)胞分離開來。從圖1中可以看出鵝胚PGCs呈圓形或橢圓形，直徑約為15～25μm，體積比體細(xì)胞大，比紅細(xì)胞大2倍左右，細(xì)胞核為圓形，分布在稍偏中心位置，細(xì)胞另一側(cè)有顏色較淺的脂滴，細(xì)胞表現(xiàn)出典型的原始生殖細(xì)胞特點。2．2鵝胚PGCs的鑒定采用糖原染色法和免疫熒光染色法對鵝胚生殖腺中分離的PGCs進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，從鵝胚生殖腺中成功分離到PGCs。糖原染色如圖2所示，深紫色的為PGCs，而其他細(xì)胞呈淡藍(lán)色，形成明顯的著色差異。抗原抗體染色是利用PGCs特異表達(dá)Vasa蛋白，將抗Vasa的多克隆抗體anti-DDX4(一抗)處理分離的細(xì)胞，再用Cy3標(biāo)記的二抗(紅色熒光)處理后于熒光顯微鏡下觀察，如圖3所示，PGCs細(xì)胞除細(xì)胞核A:鵝胚生殖腺經(jīng)胰酶-EDTA消化成單個細(xì)胞;B:混合細(xì)胞體外培養(yǎng)4h;箭頭所示為鵝胚PGCs。圖1鵝生殖腺中分離出的PGCsFig．1Primordialgermcells(PGCs)isolatedfromgoosego-nads為藍(lán)色外，細(xì)胞膜周圍呈紅色熒光，而其他類型的細(xì)胞只有細(xì)胞核為藍(lán)色，細(xì)胞膜周圍無紅色熒光。由此可見，分離出的細(xì)胞中存在一定比?

狷?養(yǎng)液，于顯微鏡下進(jìn)行觀察�？梢妱傁蟮募�(xì)胞中雜細(xì)胞很多(圖1A)，體外培養(yǎng)4h后大多數(shù)雜細(xì)胞貼壁(圖1B)，而鵝胚PGCs不貼壁，由此將鵝胚PGCs與其他細(xì)胞分離開來。從圖1中可以看出鵝胚PGCs呈圓形或橢圓形，直徑約為15～25μm，體積比體細(xì)胞大，比紅細(xì)胞大2倍左右，細(xì)胞核為圓形，分布在稍偏中心位置，細(xì)胞另一側(cè)有顏色較淺的脂滴，細(xì)胞表現(xiàn)出典型的原始生殖細(xì)胞特點。2．2鵝胚PGCs的鑒定采用糖原染色法和免疫熒光染色法對鵝胚生殖腺中分離的PGCs進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，從鵝胚生殖腺中成功分離到PGCs。糖原染色如圖2所示，深紫色的為PGCs，而其他細(xì)胞呈淡藍(lán)色，形成明顯的著色差異�？乖贵w染色是利用PGCs特異表達(dá)Vasa蛋白，將抗Vasa的多克隆抗體anti-DDX4(一抗)處理分離的細(xì)胞，再用Cy3標(biāo)記的二抗(紅色熒光)處理后于熒光顯微鏡下觀察，如圖3所示，PGCs細(xì)胞除細(xì)胞核A:鵝胚生殖腺經(jīng)胰酶-EDTA消化成單個細(xì)胞;B:混合細(xì)胞體外培養(yǎng)4h;箭頭所示為鵝胚PGCs。圖1鵝生殖腺中分離出的PGCsFig．1Primordialgermcells(PGCs)isolatedfromgoosego-nads為藍(lán)色外，細(xì)胞膜周圍呈紅色熒光，，而其他類型的細(xì)胞只有細(xì)胞核為藍(lán)色，細(xì)胞膜周圍無紅色熒光。由此可見，分離出的細(xì)胞中存在一定比例的PGCs。箭頭所示為陽性著色的PGCs。圖2鵝胚原始生殖細(xì)胞的糖原染色Fig．2Periodicacid-schiffstaining(PAS)ofgoosePGCsA:特異免疫熒光染色后PGCs呈紅色熒光;B:Hoechst33342染色后PGCs呈藍(lán)色熒光;C:B與A的疊加圖;D:明場下PGCs。圖3鵝胚原始生殖細(xì)胞的免疫熒光染色Fig．3TheimmunofluorescencestainingofPGCs于建寧等:白消安消減鵝胚內(nèi)源性原始生殖細(xì)胞865


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