【摘要】：【目的】自然界中噬菌體種類(lèi)繁多,其裂菌功能在針對(duì)細(xì)菌耐藥方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。不同噬菌體也呈現(xiàn)出顯著的基因多樣性及宿主特異性。從上海某豬場(chǎng)仔豬腸內(nèi)容物樣品中分離、純化大腸桿菌的裂解性噬菌體,分析其生物學(xué)特性和病毒學(xué)特征,為探索應(yīng)用噬菌體治療細(xì)菌性感染提供研究材料�！痉椒ā坎捎秒p層瓊脂平板法分離、純化噬菌體,觀察噬菌斑特征,通過(guò)電鏡觀察噬菌體形態(tài)特征,測(cè)定其裂菌譜、最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長(zhǎng)曲線和生物學(xué)特性,進(jìn)行噬菌體全基因組測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析。【結(jié)果】分離、純化獲得一株能高效裂解大腸桿菌K-12菌株的噬菌體,命名為v B_Eco S_SH2(SH2),噬菌斑呈圓形、大而透明、邊緣整齊。電鏡觀察SH2的頭部呈二十面體立體對(duì)稱,尾部較長(zhǎng)。噬菌體的潛伏期為10 min,暴發(fā)期為60 min,裂解量高達(dá)121 PFU/感染細(xì)胞,其最佳感染復(fù)數(shù)為0.1�；蚪M測(cè)序和比對(duì)結(jié)果表明,SH2的核酸類(lèi)型為ds DNA,基因組全長(zhǎng)為49 088 bp,G+C%含量為45%,Gen Bank登錄號(hào)為KY985004,結(jié)合電鏡觀察及BLASTp分析,確定其屬于有尾噬菌體目長(zhǎng)尾噬菌體科成員。同源性及進(jìn)化分析表明,該噬菌體為大腸桿菌T1樣噬菌體的新成員�！窘Y(jié)論】分離鑒定了一株裂解效率極高的大腸桿菌T1樣噬菌體,并確認(rèn)其為T(mén)1樣噬菌體新成員,為研究大腸桿菌噬菌體及其抗菌應(yīng)用提供了新的實(shí)驗(yàn)材料。
【圖文】：

SH2全基因組序列進(jìn)行組裝。利用RAST(RapidAnnotationusingSubsystemTechnology)和BASys(BacterialAnnotationSystem)在線注釋進(jìn)行全基因組注釋。使用NCBIBLAST在線工具進(jìn)行序列相似性比對(duì)分析，并構(gòu)建噬菌體尾絲蛋白序列的進(jìn)化樹(shù)。2結(jié)果與分析2.1大腸桿菌噬菌體的分離鑒定2.1.1噬菌體的分離及噬菌斑特征：仔豬腸內(nèi)容物樣品過(guò)濾上清與大腸桿菌K-12菌株MC1061混合后，經(jīng)雙層瓊脂平板法測(cè)定和純化，37°C培養(yǎng)6h后，在平板上能形成明顯噬菌斑。噬菌斑呈圓形、大而透明且邊緣整齊，呈現(xiàn)出裂解性噬菌體的噬菌斑特征(圖1)。2.1.2噬菌體的電鏡觀察：純化的噬菌體經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后，在透射電鏡下所觀察到的形態(tài)如圖2所示。噬菌體vB_EcoS_SH2的頭部呈二十面體立體對(duì)稱，頭部直徑約50nm，噬菌體含非收縮性尾部，，寬約8nm、長(zhǎng)約120nm。根據(jù)2012年國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)第9次報(bào)告提出的噬菌體分類(lèi)與命名標(biāo)準(zhǔn)，該噬菌體符合長(zhǎng)尾噬菌體科(Siphoviridae)特征。圖1噬菌體SH2噬菌斑形態(tài)特征Figure1MorphologicalfeatureofphageSH2plaque圖2噬菌體SH2電鏡照片F(xiàn)igure2ElectronmicrographofphageSH22.1.3噬菌體的裂菌譜：通過(guò)平板裂解實(shí)驗(yàn)及點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)(Spottestassay)檢測(cè)噬菌體對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的裂解效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該噬菌體對(duì)大腸桿菌K-12菌株MC1061、MG1655和DM1187具有極強(qiáng)的裂解效果，形成明顯的裂菌圈。對(duì)大腸桿菌O157菌株Min27，部分APEC和AFEC菌株，金黃色葡萄球菌ATCC25923和ATCC29213及豬鏈球菌HA9801均沒(méi)有明顯的裂解效果(表1)。表1噬菌體SH2宿主范圍Table1HostrangeofphageSH2菌株類(lèi)型Straintype菌株編號(hào)No.ofstrains裂菌活性Lyticactivity大腸桿菌K-12菌株(4株)E.coliK-12strains(4)MC1061+++MG1655+++DM1187+++

acterialAnnotationSystem)在線注釋進(jìn)行全基因組注釋。使用NCBIBLAST在線工具進(jìn)行序列相似性比對(duì)分析，并構(gòu)建噬菌體尾絲蛋白序列的進(jìn)化樹(shù)。2結(jié)果與分析2.1大腸桿菌噬菌體的分離鑒定2.1.1噬菌體的分離及噬菌斑特征：仔豬腸內(nèi)容物樣品過(guò)濾上清與大腸桿菌K-12菌株MC1061混合后，經(jīng)雙層瓊脂平板法測(cè)定和純化，37°C培養(yǎng)6h后，在平板上能形成明顯噬菌斑。噬菌斑呈圓形、大而透明且邊緣整齊，呈現(xiàn)出裂解性噬菌體的噬菌斑特征(圖1)。2.1.2噬菌體的電鏡觀察：純化的噬菌體經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后，在透射電鏡下所觀察到的形態(tài)如圖2所示。噬菌體vB_EcoS_SH2的頭部呈二十面體立體對(duì)稱，頭部直徑約50nm，噬菌體含非收縮性尾部，寬約8nm、長(zhǎng)約120nm。根據(jù)2012年國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)第9次報(bào)告提出的噬菌體分類(lèi)與命名標(biāo)準(zhǔn)，該噬菌體符合長(zhǎng)尾噬菌體科(Siphoviridae)特征。圖1噬菌體SH2噬菌斑形態(tài)特征Figure1MorphologicalfeatureofphageSH2plaque圖2噬菌體SH2電鏡照片F(xiàn)igure2ElectronmicrographofphageSH22.1.3噬菌體的裂菌譜：通過(guò)平板裂解實(shí)驗(yàn)及點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)(Spottestassay)檢測(cè)噬菌體對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的裂解效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該噬菌體對(duì)大腸桿菌K-12菌株MC1061、MG1655和DM1187具有極強(qiáng)的裂解效果，形成明顯的裂菌圈。對(duì)大腸桿菌O157菌株Min27，部分APEC和AFEC菌株，金黃色葡萄球菌ATCC25923和ATCC29213及豬鏈球菌HA9801均沒(méi)有明顯的裂解效果(表1)。表1噬菌體SH2宿主范圍Table1HostrangeofphageSH2菌株類(lèi)型Straintype菌株編號(hào)No.ofstrains裂菌活性Lyticactivity大腸桿菌K-12菌株(4株)E.coliK-12strains(4)MC1061+++MG1655+++DM1187+++BL21+++禽大腸桿菌(5株)APEC&AFECstrains(5)APEC-2APEC-15AFEC-8AFEC-52APEC-63

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本文編號(hào)：2556729