【摘要】：鴨甲肝病毒(Duck Hepatitis A Virus,DHAV)引起的雛鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)呈世界性分布,雛鴨發(fā)病死亡后呈現(xiàn)明顯的角弓反張癥狀,病理上以肝臟腫大出血為主要特征,具有高度傳染性和接觸性。該病發(fā)病迅速,致死率高。DHAV可分為三個基因型:DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。在我國大陸,鴨病毒性肝炎主要由DHAV-1和DHAV-3引起,兩種病毒感染雛鴨后的臨床癥狀和病理變化極為相似,臨床診斷難以對其進行區(qū)分,且生產(chǎn)中存在二者混合感染現(xiàn)象,這為該病的防治增添了困難。本研究建立了可以同時檢測DHAV-1與DHAV-3的雙重熒光定量PCR方法,并對DHAV-1和DHAV-3在山東省內的流行病學及臨床上病毒在雛鴨體內的分布進行了研究。本研究主要包括兩部分:1.檢測DHAV-1與DHAV-3的雙重熒光定量PCR方法的建立根據(jù)DHAV-1和DHAV-3基因組序列比對結果,分別于兩種病毒序列保守區(qū)設計合成了兩對能特異性擴增片段的引物和兩條TaqManTM探針,探針分別以CY5/BHQ-2和FAM/TAMRA雙標記,建立了能夠同時檢測DHAV-1和DHAV-3的雙重熒光定量PCR診斷方法。經(jīng)條件優(yōu)化后,檢測DHAV-1的標準曲線為YDHAV-1=-3.2850x+40.812,相關系數(shù)為0.998,PCR循環(huán)效率為101.5%,在6.7×103~6.7×107copies/μL內有良好的線性關系,檢測DHAV-1病毒cDNA模板的靈敏度為14copies/PCR,組內變異系數(shù)為0.28%~1.24%,組間變異系數(shù)為0.29%~0.79%;檢測DHAV-3方法中標準曲線為YDHAV-3=-3.2791x+39.216,相關系數(shù)為0.999,PCR循環(huán)效率為101.8%,在1.1×102~1.1×107copies/μL內有良好的線性關系,檢測DHAV-3病毒cDNA模板的靈敏度為22copies/PCR,與單重熒光定量PCR一致,組內變異系數(shù)為0.28%~1.81%,組間變異系數(shù)為0.22%~0.72%;特異性試驗結果顯示,同一體系內兩對特異性引物和探針只能從對應的陽性樣本中擴增出特異片段,DHAV-1和DHAV-3相互之間無交叉擴增反應,對其他七種禽類常見病原及健康鴨肝組織也無擴增,表明其特異性良好。分別應用所建立的雙重熒光定量PCR方法和常規(guī)RT-PCR方法對30份人工感染DHAV-1和DHAV-3雛鴨肝臟以及200份臨床疑似患DVH病鴨的肝臟進行檢測,結果顯示:兩種方法對人工感染DHAV-1和DHAV-3雛鴨的檢測陽性率均為100%。用熒光定量PCR方法對200份疑似患鴨病毒性肝炎病鴨的肝臟的臨床樣本進行檢測,DHAVs的檢出率為97.5%,DHAV-1的陽性檢出率為29%,DHAV-3的陽性檢測率為56.5%,混合感染陽性率為12%。送檢雛鴨共31群,4群檢出混合感染,13群DHAV-1陽性感染,13群DHAV-3陽性感染。研究結果表明建立的雙重熒光定量PCR方法具有良好的特異性和敏感性,可用于快速鑒別診斷DHAV-1和DHAV-3以及對感染雛鴨體內病毒的實時定量檢測。2.DHAV-1和DHAV-3在臨床中雛鴨體內的分布規(guī)律研究對臨床送檢的DHAV陽性病死雛鴨進行各臟器的采集,包括心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胸腺、法氏囊、腦和胰腺,應用建立的雙重熒光定量PCR法定量檢測DHAV-1和DHAV-3在雛鴨體內病毒分布情況。結果發(fā)現(xiàn):被檢組織器官中均可檢測到DHAV,但不同組織中DHAV含量差異較大,表明DHAV在雛鴨體內有廣泛的組織嗜性。剖檢可見雛鴨的肝臟、脾臟和腎臟眼觀病變最為明顯,大多呈現(xiàn)腫大和出血、壞死,熒光定量PCR檢測結果顯示,DHAV-1和DHAV-3含量最高的器官依次為肝臟和脾臟,其中DHAV-1病毒含量依次高達1012.32和1011.23copies/g,DHAV-3病毒含量依次高達1012.07、和1011.63copies/g。剖檢胸腺、胰臟有出血現(xiàn)象,法氏囊腫大,部分腦組織出現(xiàn)水腫和液化灶。胸腺、胰臟、心臟、腦和法氏囊也可檢測到DHAV,但含量略低,以上結果顯示雛鴨體內臟器病理變化的嚴重程度與病毒含量呈正相關關系,且肝臟和脾臟是DHAV增殖的理想靶器官。通過獨立樣本T檢驗分析,結果顯示,雛鴨混合感染DHAVs死亡后與單獨感染后同一器官中的病毒含量沒有明顯差異,表明混合感染對病毒在雛鴨體內的后期增殖沒有影響。送檢雛鴨的死亡日齡集中在5~14日齡,且經(jīng)Spearman相關性分析,雛鴨體內的病毒含量與雛鴨日齡沒有相關性,該結果為鴨病毒性肝炎的致病機理奠定了理論基礎。
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.32

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 謝麗基;謝芝勛;龐耀珊;謝志勤;劉加波;鄧顯文;范晴;;鴨Ⅰ型肝炎病毒熒光定量RT-PCR方法建立及初步應用[J];中國家禽;2012年10期

2 張小飛;吳亦倫;趙瑞宏;潘孝成;盛曉蓉;陳鑫;;免疫酶組化法對試驗感染雛鴨體內鴨肝炎病毒的分布測定[J];中國獸醫(yī)雜志;2005年12期

相關碩士學位論文 前1條

1 劉建;鴨肝炎病毒的分離與檢測[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2004年

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本文編號：2551673