【摘要】：犬細(xì)小病毒性腸炎（Canine parvovirus enteritis）是由犬細(xì)小病毒（Canineparvovirus, CPV）引起的在犬科動物中廣泛傳播和流行的一種高度接觸性傳染病，患病犬主要表現(xiàn)為劇烈嘔吐、腹瀉、出血性腸炎和非化膿性心肌炎，是危害我國養(yǎng)犬業(yè)和寵物業(yè)的重要疫病之一。目前，該病沒有特效的治療方法，主要依靠接種疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防。因此，快速檢測犬細(xì)小病毒的抗原和抗體對于犬細(xì)小病毒性腸炎的預(yù)防、診斷、治療和流行病學(xué)分析具有重要意義。本研究從以下三部分針對犬細(xì)小病毒抗原和抗體檢測開展了研究，建立了犬細(xì)小病毒性腸炎的兩種快速檢測方法：檢測犬細(xì)小病毒抗體的間接ELISA方法和檢測犬細(xì)小病毒抗原的免疫膠體金試紙條。 1犬細(xì)小病毒抗體間接ELISA檢測方法的建立 本部分研究采用飽和硫酸銨沉淀、蔗糖密度梯度離心法對利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的犬細(xì)小病毒病毒樣顆粒（CPV-VLPs）進(jìn)行純化，，并以純化后的CPV-VLPs作為包被抗原建立了犬細(xì)小病毒抗體間接ELISA檢測方法。結(jié)果表明：純化后CPV-VLPs純度達(dá)90%以上，經(jīng)SDS-PAGE和Westernblotting鑒定純化后CPV-VLPs在約70KD處有單一條帶，能和CPV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。經(jīng)過優(yōu)化的間接ELISA工作條件為：抗原包被濃度為5ug/mL，4℃包被過夜；1%BSA37℃封閉2h；待檢血清1:40稀釋，37℃孵育1.5h；酶標(biāo)二抗1:20,000稀釋，37℃孵育1h；TMB室溫避光顯色30min，0.5M H2SO4終止顯色，在450nm波長處測定OD值。該ELISA抗體檢測方法的特點是：1）特異性強(qiáng)：可特異性檢測CPV陽性血清，而不與CDV、RABV、ICHV、CCV陽性血清發(fā)生非特異性反應(yīng)；2）敏感性良好：當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清1:640稀釋后仍能檢測出陽性；3）重復(fù)性好：批內(nèi)和批間重復(fù)試驗變異系數(shù)均小于10%；4）符合率高：使用該方法和血凝抑制試驗（HI）分別對42份臨床血清樣本進(jìn)行抗體檢測，二者的符合率達(dá)90.48%。 2犬細(xì)小病毒單克隆抗體的制備及特性鑒定 本部分研究采用PEG沉淀、蔗糖密度梯度離心法純化F81細(xì)胞培養(yǎng)的CPV，并以此制備免疫原免疫6-8周齡Balb/c小鼠，經(jīng)過3次免疫后血清ELISA效價達(dá)到1:105，加強(qiáng)免疫后3天采用PEG誘導(dǎo)融合法進(jìn)行免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的融合。使用間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，利用有限稀釋法克隆篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過3次克隆獲得3株能夠穩(wěn)定分泌犬細(xì)小病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1A3、6B10、7F12。3株雜交瘤細(xì)胞經(jīng)間接ELISA方法檢測細(xì)胞上清抗體效價分別為1:103、1:103、1:103，小鼠腹水抗體效價分別為1:106、1:105、1:107；經(jīng)HI試驗檢測細(xì)胞上清抗體效價分別為28、28、28，小鼠腹水抗體效價分別為215、214、215；經(jīng)亞類鑒定1A3為IgG2a亞型，6B10為IgG3亞型，7F12為IgG2b亞型。3株雜交瘤細(xì)胞經(jīng)連續(xù)傳代和凍存、復(fù)蘇后，其細(xì)胞上清ELISA效價不變。以上數(shù)據(jù)表明：篩選獲得的3株單克隆抗體特異性高，不僅能和犬細(xì)小病毒發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，且具有特異性的血凝抑制作用。 3犬細(xì)小病毒免疫膠體金檢測試紙條的制備與應(yīng)用 本部分研究采用飽和硫酸銨沉淀、Protein G蛋白親和層析柱純化1A3、7F12兩株單抗，純化后蛋白濃度分別為3.21mg/mL和5.421mg/mL。采用檸檬酸三鈉還原法燒制膠體金，利用純化后的1A3單抗標(biāo)記膠體金，以純化后的7F12單抗作為檢測線，羊抗鼠IgG作為質(zhì)控線，根據(jù)雙抗體夾心原理制備犬細(xì)小病毒免疫膠體金檢測試紙條。該試紙條能特異性的檢測出細(xì)小病毒屬的CPV、MEV、FPV，而不與CDV、RABV、ICHV、CCV發(fā)生非特異性反應(yīng)；敏感性為80個HA單位/mL；分別采用不同方法對90份臨床糞便樣品進(jìn)行檢測，與PCR試驗相比，本研究制備的CPV免疫膠體金檢測試紙條的敏感性和特異性分別是94.4%和100%，總符合率是95.6%；與PCR相比，韓國Bioindist公司CPV免疫膠體金檢測試紙條的敏感性和特異性分別是97.3%和88.9%，總符合率是95.6%。以上結(jié)果表明：所制備的細(xì)小病毒免疫膠體金檢測試紙條特異性和敏感性好，操作簡便、快速，適用于臨床樣品的大量、快速檢測。
【圖文】：

次純化的 CPV-VLPs 作為包被抗原，在相同時間對 5 份陽性血清和 1 份陰性血清進(jìn)行檢測，每批抗原同一份血清重復(fù) 2 次，統(tǒng)計學(xué)分析不同批次抗原對同一血清的檢測結(jié)果，計算批間變異系數(shù)。2.3.4 臨床樣品檢測采用本研究建立的間接 ELISA 方法檢測從吉林、遼寧等地采集的 42 份臨床血清樣本，同時進(jìn)行血凝抑制試驗做對比，計算二者的符合率。3 結(jié)果3.1 CPV-VLPs 制備及純化3.1.1 CPV-VLPs 的培養(yǎng)結(jié)果在顯微鏡下觀察，正常的昆蟲細(xì)胞呈圓形、透亮、緊密排列、緊貼平皿底部生長，接種表達(dá)犬細(xì)小病毒 VP2 蛋白的重組桿狀病毒后，可見細(xì)胞腫脹，體積明顯增大，貼壁不牢，出現(xiàn)大量因脫落而懸浮的細(xì)胞，。

圖 1.2 電鏡下觀察純化后 CPV-VLPsg.1.2 The CPV-VLPs detected by electron mi-VLPs 的 SDS-PAGE 分析結(jié)果E 對純化前后的 CPV-VLPs 進(jìn)行比較，結(jié)果無雜蛋白存在，僅有單一條帶，大約在 70KD。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S855.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2551471