【摘要】：豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus,PPV)引起的豬細(xì)小病毒病是豬的一種繁殖障礙性傳染病,其臨床癥狀主要為妊娠母豬流產(chǎn),初產(chǎn)母豬產(chǎn)畸形胎、木乃伊胎、死胎等。PPV可在豬的多種傳代細(xì)胞如豬睪丸(swine testicle,ST)細(xì)胞、豬腎(porcine kidney-15,PK-15)細(xì)胞等中增殖,并引起明顯的細(xì)胞病變,但引起細(xì)胞病變效應(yīng)的分子機(jī)理尚不明確。本研究以ST細(xì)胞為主要研究對(duì)象,首先檢測(cè)PPV感染ST細(xì)胞后細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo),明確細(xì)胞發(fā)生了凋亡,然后對(duì)PPV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路及活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)在細(xì)胞凋亡中的作用進(jìn)行初步探索。研究得到如下結(jié)果。1.PPV感染對(duì)ST細(xì)胞凋亡的影響利用不同滴度的PPV感染ST細(xì)胞,檢測(cè)PPV感染不同時(shí)間后的細(xì)胞活性,結(jié)果表明,PPV感染可抑制ST細(xì)胞活性,且呈現(xiàn)感染時(shí)間和感染劑量的依賴(lài)性;利用AO/EB雙染法檢測(cè)PPV感染后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化,結(jié)果表明,PPV感染ST細(xì)胞后,細(xì)胞出現(xiàn)核內(nèi)染色質(zhì)固縮、細(xì)胞核皺縮和碎裂;瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,1.0個(gè)病毒感染復(fù)數(shù)(1.0 multiplicity of infection,1.0 MOI)的PPV感染ST細(xì)胞48 h后,細(xì)胞內(nèi)的染色體DNA電泳出現(xiàn)明顯的梯狀條帶;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PPV感染對(duì)ST細(xì)胞凋亡率的影響,結(jié)果顯示,ST細(xì)胞的凋亡率隨著病毒感染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高。2.PPV感染對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Caspase活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn),PPV感染ST細(xì)胞能夠顯著激活細(xì)胞內(nèi)Caspase-9及Caspase-3,而Caspase-8的活性無(wú)顯著變化,結(jié)果表明,PPV可通過(guò)Caspase-9/-3級(jí)聯(lián)活化來(lái)誘導(dǎo)ST細(xì)胞發(fā)生凋亡。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,PPV感染對(duì)ST細(xì)胞內(nèi)Fas和FasL的表達(dá)量無(wú)顯著影響,但PPV感染能夠上調(diào)細(xì)胞內(nèi)促凋亡分子Bax的表達(dá),下調(diào)細(xì)胞內(nèi)的抑凋亡分子Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞漿中的Bax轉(zhuǎn)位到線粒體中及線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素c(Cytochrome c,Cyt c)釋放到細(xì)胞漿中,進(jìn)而導(dǎo)致了Caspase-3的底物PARP的切割。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示,隨著B(niǎo)ax的轉(zhuǎn)位,線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,Δψm)發(fā)生去極化的細(xì)胞比率逐漸增加。3.ROS在PPV感染誘導(dǎo)的ST細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用熒光顯微鏡觀察及流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明,PPV感染ST細(xì)胞能夠引起細(xì)胞內(nèi)ROS的積累。用抗氧化劑PDTC和NAC處理ST細(xì)胞,結(jié)果顯示,PDTC和NAC能夠抑制PPV感染引起的ROS積累,降低線粒體膜電位去極化的細(xì)胞比率,阻礙Bcl-2表達(dá)量的下調(diào),Bax的轉(zhuǎn)位以及Cyt c的釋放,下調(diào)細(xì)胞胞內(nèi)Caspase-3的活性和細(xì)胞凋亡率。本研究表明了PPV可以誘導(dǎo)ST細(xì)胞發(fā)生凋亡,闡明了PPV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是通過(guò)線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)施的,初步探索了ROS在PPV誘導(dǎo)ST細(xì)胞發(fā)生凋亡過(guò)程中的作用及機(jī)制,為進(jìn)一步探索PPV感染對(duì)宿主細(xì)胞的致病機(jī)制提供理論依據(jù),同時(shí)也為研究其它豬病病毒的致病機(jī)制提供新思路。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S855.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 藺文成;胡峰;任梅;崔玉東;錢(qián)愛(ài)東;崔尚金;;豬細(xì)小病毒病國(guó)內(nèi)流行狀況以及防治策略[J];豬業(yè)科學(xué);2010年09期

2 郭春紅;董雅文;侯月梅;;豬細(xì)小病毒病防控[J];四川畜牧獸醫(yī);2011年03期

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本文編號(hào)：2549371