發(fā)布時(shí)間：2019-10-13 04:12

【摘要】：狂犬病是一種人或其他溫血?jiǎng)游锏牟《拘阅X脊髓炎,在家畜和野生動(dòng)物之間可以自然感染與傳播,感染后一旦出現(xiàn)臨床癥狀,致死率幾乎100%。其病原體是彈狀病毒科狂犬病毒屬的狂犬病毒(Rabies virus,RABV)�？袢《居梢粭l單股負(fù)鏈RNA和五種結(jié)構(gòu)蛋白組成,其中磷酸化蛋白P作為一種多功能的非催化活性蛋白,在病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用。迄今為止,雖然有研究表明狂犬病病毒P蛋白既能與其自身的結(jié)構(gòu)蛋白相互作用,又能與宿主細(xì)胞的某些蛋白互作,并參與病毒的生活周期調(diào)控,但這方面的研究還相當(dāng)有限,狂犬病毒的致病機(jī)致仍未完全闡明。本研究通過(guò)噬菌體展示技術(shù),篩選出與狂犬病毒P蛋白相互作用的宿主核糖體蛋白L9,對(duì)其進(jìn)行了體內(nèi)、外驗(yàn)證,并深入研究了其對(duì)病毒復(fù)制的影響,為進(jìn)一步闡明狂犬病毒的復(fù)制和致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。1、RABV-P宿主相互作用蛋白的篩選為了進(jìn)一步了解狂犬病毒的致病機(jī)制,探索P蛋白的生物學(xué)功能,首先從狂犬病毒cDNA中擴(kuò)增并克隆了P基因,利用大腸桿菌表達(dá)并純化了P蛋白;進(jìn)一步通過(guò)人腦T7噬菌體展示技術(shù),經(jīng)過(guò)五輪篩選,用ELISA,BLAST對(duì)比和讀碼框校對(duì)等確定了13種與P蛋白相互作用的候選蛋白。2、L9與P蛋白相互作用的驗(yàn)證為了驗(yàn)證13種候選蛋白是否與P蛋白直接相互作用,構(gòu)建了所有候選基因與GST標(biāo)簽的融合表達(dá)質(zhì)粒,利用原核表達(dá)并純化了相關(guān)融合蛋白。DOT-pull-down試驗(yàn)表明L9與RABV-P有明顯的相互作用。通過(guò)GST-pull-down試驗(yàn)證明L9與RABV-P在體外可以直接相互作用。為了排除體外非特異的環(huán)境造成假陽(yáng)性的結(jié)果,在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了L9與P蛋白,通過(guò)Co-IP試驗(yàn)進(jìn)一步證明RABV-P蛋白與L9相互作用。P蛋白與L9在細(xì)胞的什么部位相互作用?為了回答這個(gè)問(wèn)題,構(gòu)建了P融合綠色熒光蛋白GFP和L9融合表達(dá)紅色熒光蛋白DsRed的真核表達(dá)質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)HEK-293T細(xì)胞,共聚焦熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示P蛋白招募大多數(shù)細(xì)胞核中的L9蛋白共定位于細(xì)胞質(zhì)中,顯示P與L9在細(xì)胞質(zhì)中有相互作用的可能。為了進(jìn)一步確證以上結(jié)果在自然狀態(tài)下能否發(fā)生,用rabv感染hek-293t細(xì)胞,間接免疫熒光試驗(yàn)顯示l9與p蛋白仍然共定位于細(xì)胞質(zhì)3、l9與p蛋白相互作用區(qū)域的確定為了確定l9與p蛋白的相互作用位點(diǎn),利用pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了一系列研究。首先,將p基因做了p19-297、p52-297、p82-297、p138-297、p172-297、p1-137、p1-180andp1-218等8個(gè)截短,并分別表達(dá)、純化相應(yīng)蛋白,然后與帶有g(shù)st標(biāo)簽的l9蛋白進(jìn)行g(shù)st-pull-down試驗(yàn),結(jié)果顯示l9與p蛋白的138位至180位氨基酸區(qū)域相互作用。為了確證這一結(jié)果,我們構(gòu)建了缺失該區(qū)域的表達(dá)質(zhì)粒(pΔ138-180),通過(guò)類似的方法證明pΔ138-180蛋白不能與p蛋白結(jié)合,進(jìn)一步驗(yàn)證了前面的結(jié)果。為了確定p蛋白在l9蛋白上的結(jié)合位點(diǎn),根據(jù)l9蛋白結(jié)構(gòu),我們構(gòu)建并表達(dá)了l91-39、l91-61、l91-85、l962-192、l986-192和l997-192等6個(gè)截短突變體。his-pull-down結(jié)果表明l9的n端39個(gè)氨基酸與p蛋白的相互作用無(wú)關(guān)。4、l9對(duì)rabv生物學(xué)功能的研究在細(xì)胞水平上過(guò)表達(dá)l9,通過(guò)檢測(cè)rabv報(bào)告基因的表達(dá)水平研究l9對(duì)病毒復(fù)制的影響,結(jié)果表明過(guò)表達(dá)l9能夠顯著抑制rabv的復(fù)制(10-20倍);western-blot的結(jié)果顯示p蛋白的表達(dá)量較對(duì)照下降了60-70%。為了進(jìn)一步確證l9抑制rabv的復(fù)制是否具有特異性,在過(guò)表達(dá)l9的條件下測(cè)定了vsv的生長(zhǎng)曲線,結(jié)果顯示vsv的復(fù)制與對(duì)照沒有顯著差異。以上結(jié)果表明l9過(guò)表達(dá)能特異性地抑制rabv的復(fù)制。那么降低l9的表達(dá)或敲除l9對(duì)rabv的情況會(huì)是怎樣呢?為了回答這個(gè)問(wèn)題,合成了l9特異的sirna和無(wú)關(guān)rna。將sirna轉(zhuǎn)染hek-293t細(xì)胞,感染rabv,結(jié)果顯示干擾l9能夠顯著增強(qiáng)rabv復(fù)制(4-5倍);p蛋白表達(dá)量升高了50%以上。以上結(jié)果表明l9對(duì)rabv的復(fù)制具有重要的調(diào)節(jié)作用。5、l9與p蛋白互作干擾了rabv的轉(zhuǎn)錄為了確定l9與rabv互作發(fā)生在病毒生活周期的哪一步,我們檢測(cè)了在l9過(guò)表達(dá)時(shí)病毒基因組rna和mrna的變化,研究其對(duì)復(fù)制或轉(zhuǎn)錄的影響,并用chx處理抑制細(xì)胞的翻譯過(guò)程。結(jié)果顯示,無(wú)論是否用chx處理細(xì)胞,過(guò)表達(dá)l9的情況下,病毒mrna和基因組rna的拷貝數(shù)均顯著顯著低于對(duì)照。為了確認(rèn)此結(jié)果的特異性,在同等條件下以VSV為對(duì)象重復(fù)了上述試驗(yàn),結(jié)果表明L9過(guò)表達(dá)與否對(duì)VSV的mRNA拷貝數(shù)無(wú)顯著影響。
【圖文】：

在300-3000 bp之間，所表達(dá)的多肽或蛋白以與噬菌體外殼蛋白融合的形式展示在噬菌體表面，大小在50-1200aa。T7噬菌體展示篩選系統(tǒng)的原理和過(guò)程與其它噬菌體展示篩選系統(tǒng)類似 (如圖1-1)圖 1-1 噬菌體展示技術(shù)示意圖Figrue 1-1 Phage display technology schematic diagram用噬菌體展示技術(shù)篩選狂犬病 P 蛋白與宿主細(xì)胞的相互作用的因子或伙伴蛋白成為可能，為深入研究狂犬病的致病機(jī)理提供技術(shù)支持。1.2 文獻(xiàn)綜述1.2.1 狂犬病狂犬病，又名 瘋狗病‖，是人或其他溫血?jiǎng)游锏囊环N病毒性腦脊髓炎，其病原體是彈狀病毒科狂犬病病毒屬的狂犬病病毒。本病嚴(yán)重影響家畜和野生動(dòng)物，在家畜和野生動(dòng)物之間可以自然感染與傳播，，并通過(guò)密切接觸傳染性物質(zhì)，如唾液等傳

1.2.2 狂犬病病毒的結(jié)構(gòu)特征1.2.2.1 狂犬病病毒的形態(tài)與結(jié)構(gòu)病毒粒子呈子彈狀（圖1-2），直徑約75-80nm, 長(zhǎng)度約170-300nm。病毒外殼為宿主細(xì)胞來(lái)源的脂蛋白雙層包膜，其表面鑲嵌有大量G蛋白纖突（5-10nm,直徑約3nm）。圓形糖蛋白纖突由三個(gè)糖基化的外部功能區(qū)組成，突起于病毒囊膜，連接病毒和宿主細(xì)胞受體。病毒粒子中間層則由呈螺旋形式規(guī)律排列的M蛋白組成， M蛋白形成的低聚物結(jié)合在核衣殼的外側(cè)，保持病毒結(jié)構(gòu)的硬度并提供給病毒糖蛋白及其囊膜一個(gè)結(jié)合平臺(tái)。病毒粒子內(nèi)層是具有實(shí)際感染力的核衣殼(nucleocapsid,NC)，核衣殼由病毒基因組RNA和緊密包裹在外面的N蛋白組成。每個(gè)N蛋白分子結(jié)合9個(gè)核苷酸分子并完全包裹病毒基因組RNA，然后形成螺旋形的、長(zhǎng)的N-RNA復(fù)合體（Schoehn et al.,2001）。核衣殼通過(guò)很重要的比例與由297個(gè)氨基酸組成的磷酸化蛋白P相互作用
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

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