【摘要】：本研究旨在利用RNA-seq技術(shù)從轉(zhuǎn)錄組學(xué)角度探討犏牛囊胚玻璃化冷凍的損傷機(jī)制。采用體外受精(IVF)技術(shù)生產(chǎn)犏牛胚胎(奶牛精子×牦牛卵子),以新鮮犏牛囊胚和經(jīng)玻璃化冷凍復(fù)蘇后的凍融囊胚為研究對象,提取總RNA,使用Smart-seq2方法進(jìn)行擴(kuò)增并構(gòu)建文庫進(jìn)行高通量測序。結(jié)果表明:新鮮囊胚和凍融囊胚樣本經(jīng)深度測序后,分別得到51 099 116和54 192 358條Clean Reads,其中80%以上Clean Reads被比對上參考基因組。凍融囊胚相對于新鮮囊胚共篩選出11 196個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs),其中上調(diào)表達(dá)基因有7 570個(gè),下調(diào)表達(dá)基因有3 626個(gè)。新鮮囊胚和凍融囊胚可變剪切數(shù)分別有49 016和64 352個(gè);SNP位點(diǎn)數(shù)量分別為116 681和224 750個(gè)。差異基因GO功能分析主要富集于生物過程、細(xì)胞組成和分子功能3大類;KEGG注釋結(jié)果表明,凍融囊胚與新鮮囊胚間共涉及318條通路,其中14條通路顯著富集。推測犏牛囊胚冷凍損傷機(jī)制可能是通過剪接體、泛素介導(dǎo)蛋白水解和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工等通路的相互協(xié)調(diào)以及Prp19、Prp4、CaM、PKA、Hsp70、CCL2等基因的差異表達(dá)來發(fā)揮生物學(xué)作用。綜上表明,本研究利用RNA-seq技術(shù)首次從轉(zhuǎn)錄組學(xué)角度探討了犏牛囊胚玻璃化冷凍的損傷機(jī)制,為完善胚胎的玻璃化冷凍提供新思路,同時(shí)也為進(jìn)一步完善犏�；蚪Y(jié)構(gòu)信息和胚胎玻璃化冷凍相關(guān)的新基因提供理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)４８卷圖３差異表達(dá)基因火山圖Ｆｉｇ．３Ｔｈｅｖｏｌｃａｎｏｐｌｏｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓ２．４差異基因ＫＥＧＧ通路分析為了進(jìn)一步了解獲得的預(yù)測蛋白的生物學(xué)功能及相互作用，將所有的預(yù)測蛋白與ＫＥＧＧ蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了比對。在犏牛凍融囊胚與新鮮囊胚間差異表達(dá)基因通路功能注釋中，共有１２３１５個(gè)ｕｎｉｇｅｎｅ注釋到３１８條通路，其中有１４條顯著富集（表４）。其中，剪接體通路和泛素介導(dǎo)蛋白水解通路二者富集程度最高，且犏牛凍融囊胚相比新鮮囊胚大部分ＤＥＧｓ上調(diào)表達(dá)。篩選出重要Ｐａｔｈｗａｙ及所包含的相關(guān)差異表達(dá)基因見表５。２．５差異表達(dá)基因的ＲＴ－ｑＰＣＲ驗(yàn)證為驗(yàn)證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，根據(jù)測序結(jié)果隨機(jī)選�。磦�(gè)差異表達(dá)基因（ＤＥＧｓ）（２個(gè)上調(diào)ＤＥＧｓ，２個(gè)下調(diào)ＤＥＧｓ），并選取Ｈ２Ａ作為內(nèi)參基因，采用ＲＴ－ｑＰＣＲ方法驗(yàn)證ＤＥＧｓ的表達(dá)情況。以新鮮囊胚為基礎(chǔ)，分別以單細(xì)胞ＲＮＡ－ｓｅｑ和ＲＴ－ｑＰＣＲ兩種方法測得的ｍＲＮＡ表達(dá)量數(shù)據(jù)來分析基因表達(dá)差異倍數(shù)［即ｌｏｇ２（凍融囊胚表達(dá)量／新鮮囊胚表達(dá)量）］。結(jié)果表明，單細(xì)胞ＲＮＡ－ｓｅｑ和ＲＴ－ｑＰＣＲ兩種方法計(jì)算得到的差異倍數(shù)基本一致（圖５）。驗(yàn)證說明了高通量測序的準(zhǔn)確性。３討論本研究應(yīng)用Ｓｍａｒｔ－Ｓｅｑ２方法對犏牛新鮮囊胚和凍融囊胚進(jìn)行富集擴(kuò)增，充分保持原有ｍＲＮＡ種類的復(fù)雜性，保證了擴(kuò)增樣本的測序數(shù)據(jù)具有和原始未擴(kuò)增富集樣本的測序數(shù)據(jù)的一致性。使用ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉ

胚表達(dá)量）］。結(jié)果表明，單細(xì)胞ＲＮＡ－ｓｅｑ和ＲＴ－ｑＰＣＲ兩種方法計(jì)算得到的差異倍數(shù)基本一致（圖５）。驗(yàn)證說明了高通量測序的準(zhǔn)確性。３討論本研究應(yīng)用Ｓｍａｒｔ－Ｓｅｑ２方法對犏牛新鮮囊胚和凍融囊胚進(jìn)行富集擴(kuò)增，充分保持原有ｍＲＮＡ種類的復(fù)雜性，，保證了擴(kuò)增樣本的測序數(shù)據(jù)具有和原始未擴(kuò)增富集樣本的測序數(shù)據(jù)的一致性。使用ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２５００平臺(tái)對犏牛新鮮囊胚和凍融囊胚進(jìn)行了高通量測序，經(jīng)一系列數(shù)據(jù)處理分析得到１１１９６個(gè)ＤＥＧｓ。圖４差異表達(dá)基因的ＧＯ功能分類Ｆｉｇ．４Ｇｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓ１８７６
【作者單位】： 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院;
【基金】：中央高�；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2015NZYTD02)
【分類號(hào)】：S823.85

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