【摘要】：miRNA廣泛在哺乳動(dòng)物卵巢中表達(dá),對(duì)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和卵巢的功能具有關(guān)鍵調(diào)控作用。眾多研究表明,miR-101與miR-144調(diào)控多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡。但是目前尚未有miR-101與miR-144調(diào)控奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞的研究。本研究以關(guān)中奶山羊?yàn)檠芯繉?duì)象,采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建等方法驗(yàn)證miR-101與miR-144的靶基因;采用RT-q PCR、Western blot檢測(cè)技術(shù)研究miR-101與miR-144對(duì)靶基因TGIF1的調(diào)控作用;采用流式細(xì)胞術(shù)等方法研究miR-101與miR-144對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用機(jī)制;以期闡明miR-101與miR-144調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞的作用機(jī)制,為提高奶山羊產(chǎn)羔率提供試驗(yàn)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1、在奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞中,驗(yàn)證miR-101、miR-144與TGIF1基因的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系(1)利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)了TGIF1基因3′UTR區(qū)含有miR-101和miR-144的靶位點(diǎn)。構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告載體,分別將miR-101和miR-144的模擬物以及Negative control(NC)與TGIF1-3′UTR區(qū)雙熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中,檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果表明,與NC組相比,miR-101和miR-144分別顯著抑制熒光素酶活性。而將NC、miR-101和miR-144的模擬物與突變載體共轉(zhuǎn)染,檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示,與NC組相比,miR-101和miR-144對(duì)突變載體的熒光素酶活性沒有顯著影響。據(jù)此初步鑒定TGIF1基因?yàn)閙iR-101和miR-144的靶基因。(2)采用RT-q PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)miR-101和miR-144對(duì)靶基因TGIF1的表達(dá)調(diào)控,同時(shí)檢測(cè)TGIF1基因在山羊組織中的表達(dá)情況。分別將NC、miR-101和miR-144的模擬物以及抑制劑轉(zhuǎn)染至奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞中,結(jié)果顯示,與NC組相比,miR-101和miR-144分別顯著下調(diào)靶基因TGIF1在m RNA和蛋白水平上的表達(dá);而轉(zhuǎn)染miR-101和miR-144的抑制劑之后,顯著上調(diào)TGIF1基因在m RNA和蛋白水平上的表達(dá)。同時(shí)根據(jù)RT-q PCR的檢測(cè)結(jié)果,顯示在奶山羊的子宮、卵巢和乳腺中,TGIF1基因的表達(dá)相對(duì)較高。2、研究miR-101與miR-144對(duì)奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用機(jī)制(1)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-101與miR-144對(duì)奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果表明,與NC組相比,過表達(dá)miR-101與miR-144使顆粒細(xì)胞的凋亡率顯著升高。(2)采用Western blot技術(shù)檢測(cè)Bcl-2、Bax和p53等凋亡基因的蛋白表達(dá),結(jié)果表明,與NC組相比,miR-101和miR-144顯著下調(diào)Bcl-2和Bax凋亡基因的蛋白表達(dá),顯著降低Bcl-2/Bax的蛋白比值;與NC組相比,miR-101和miR-144顯著上調(diào)p53磷酸化水平。以上結(jié)果表明,TGIF1基因在奶山羊的子宮、卵巢和乳腺中的表達(dá)相對(duì)較高;在奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞中,miR-101與miR-144負(fù)調(diào)控靶基因TGIF1;miR-101與miR-144可能通過下調(diào)Bcl-2/Bax的比值,上調(diào)p53磷酸化水平來促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡。
【圖文】：

圖 1-1 卵泡發(fā)育過程(王珊, 2016)Fig.1-1 Development process of follicle中顆粒細(xì)胞的研究進(jìn)展細(xì)胞（GCs）是卵泡發(fā)育和閉鎖過程中最重要的體細(xì)胞，，對(duì)卵泡局要作用。早期顆粒細(xì)胞是由卵泡上皮細(xì)胞分化而來(蔣天f惖

本文編號(hào)：2541417