【摘要】：miRNA廣泛在哺乳動物卵巢中表達,對卵泡的生長發(fā)育和卵巢的功能具有關鍵調控作用。眾多研究表明,miR-101與miR-144調控多種細胞的生長、分化和凋亡。但是目前尚未有miR-101與miR-144調控奶山羊卵巢顆粒細胞的研究。本研究以關中奶山羊為研究對象,采用生物信息學預測和雙熒光素酶報告載體構建等方法驗證miR-101與miR-144的靶基因;采用RT-q PCR、Western blot檢測技術研究miR-101與miR-144對靶基因TGIF1的調控作用;采用流式細胞術等方法研究miR-101與miR-144對卵巢顆粒細胞凋亡的調控作用機制;以期闡明miR-101與miR-144調控卵巢顆粒細胞的作用機制,為提高奶山羊產(chǎn)羔率提供試驗依據(jù)。主要研究結果如下:1、在奶山羊卵巢顆粒細胞中,驗證miR-101、miR-144與TGIF1基因的靶向調節(jié)關系(1)利用生物信息學軟件預測了TGIF1基因3′UTR區(qū)含有miR-101和miR-144的靶位點。構建雙熒光素酶報告載體,分別將miR-101和miR-144的模擬物以及Negative control(NC)與TGIF1-3′UTR區(qū)雙熒光素酶報告載體共轉染到293T細胞中,檢測熒光素酶活性。結果表明,與NC組相比,miR-101和miR-144分別顯著抑制熒光素酶活性。而將NC、miR-101和miR-144的模擬物與突變載體共轉染,檢測熒光素酶活性。結果顯示,與NC組相比,miR-101和miR-144對突變載體的熒光素酶活性沒有顯著影響。據(jù)此初步鑒定TGIF1基因為miR-101和miR-144的靶基因。(2)采用RT-q PCR和Western blot技術檢測miR-101和miR-144對靶基因TGIF1的表達調控,同時檢測TGIF1基因在山羊組織中的表達情況。分別將NC、miR-101和miR-144的模擬物以及抑制劑轉染至奶山羊卵巢顆粒細胞中,結果顯示,與NC組相比,miR-101和miR-144分別顯著下調靶基因TGIF1在m RNA和蛋白水平上的表達;而轉染miR-101和miR-144的抑制劑之后,顯著上調TGIF1基因在m RNA和蛋白水平上的表達。同時根據(jù)RT-q PCR的檢測結果,顯示在奶山羊的子宮、卵巢和乳腺中,TGIF1基因的表達相對較高。2、研究miR-101與miR-144對奶山羊卵巢顆粒細胞凋亡的調控作用機制(1)采用流式細胞術檢測miR-101與miR-144對奶山羊卵巢顆粒細胞凋亡的影響,結果表明,與NC組相比,過表達miR-101與miR-144使顆粒細胞的凋亡率顯著升高。(2)采用Western blot技術檢測Bcl-2、Bax和p53等凋亡基因的蛋白表達,結果表明,與NC組相比,miR-101和miR-144顯著下調Bcl-2和Bax凋亡基因的蛋白表達,顯著降低Bcl-2/Bax的蛋白比值;與NC組相比,miR-101和miR-144顯著上調p53磷酸化水平。以上結果表明,TGIF1基因在奶山羊的子宮、卵巢和乳腺中的表達相對較高;在奶山羊卵巢顆粒細胞中,miR-101與miR-144負調控靶基因TGIF1;miR-101與miR-144可能通過下調Bcl-2/Bax的比值,上調p53磷酸化水平來促進顆粒細胞的凋亡。
【圖文】：

圖 1-1 卵泡發(fā)育過程(王珊, 2016)Fig.1-1 Development process of follicle中顆粒細胞的研究進展細胞（GCs）是卵泡發(fā)育和閉鎖過程中最重要的體細胞，，對卵泡局要作用。早期顆粒細胞是由卵泡上皮細胞分化而來(蔣天f惖

本文編號：2541417