【摘要】：豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus),的DNA病毒,其核酸分子為單股、首尾閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu),無(wú)囊膜。PCV目前有兩個(gè)基因型PCV1和PCV2。PCV2又可分為5個(gè)亞型PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、和PCV2e。PCV2本身不致死豬,但可造成免疫抑制。PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原,當(dāng)與其它病原混合感染時(shí),可加重病豬的死亡,給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的損失。近些年來(lái),豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)的基因亞型持續(xù)發(fā)生演變,讓流行形勢(shì)變得復(fù)雜。本文通過(guò)采集江蘇部分地區(qū)病死豬的病料及揚(yáng)州某規(guī)�；涝讏�(chǎng)樣品,利用PCR方法對(duì)六種常可發(fā)生混合感染的病毒即豬圓環(huán)病毒Ⅰ型(Porcine circovius type 1,PCV1)、豬圓環(huán)病毒 Ⅱ 型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、偽狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)、豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)和豬藍(lán)耳病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)進(jìn)行檢測(cè),對(duì)檢測(cè)為 PCV2陽(yáng)性的病料用Dulac細(xì)胞進(jìn)行病毒的分離純化和毒力測(cè)定。對(duì)部分純化的毒株測(cè)序并作遺傳進(jìn)化分析,為該病的流行及變異情況提供相關(guān)的數(shù)據(jù)。另外,挑選部分分離株作人工感染實(shí)驗(yàn)可更好地研究該病毒的致病機(jī)理,為疫苗研究打下基礎(chǔ)。研究1.2015-2016年江蘇部分地區(qū)PCV2及幾種常見(jiàn)病原的流行病學(xué)調(diào)查2015～2016年間在江蘇部分地區(qū)共采集575份病死豬淋巴結(jié)組織檢測(cè)發(fā)現(xiàn),46份病料為PCV1陽(yáng)性;287份病料為PCV2陽(yáng)性;133份病料為PPV陽(yáng)性;80份病料為PRV陽(yáng)性;34份病料為PRRSV陽(yáng)性;39份病料為CSFV陽(yáng)性;PCV1、PCV2、PPV、PRV、PRRSV、CSFV陽(yáng)性率分別為8%、50%、23%、14%、6%和7%:其中在混合感染中,以PCV2和PPV的混合感染率最高,有70份,占總數(shù)的17.5%;PCV2和PCV1的混合感染有46份,占總數(shù)的11.5%;PCV2和PRV的混合感染有35份,占總數(shù)的8.7%。為了監(jiān)測(cè)江蘇部分地區(qū)PCV2的流行特點(diǎn),在2015～2016年間采集病死豬病料用PCR技術(shù)檢測(cè)PCV2病毒核酸,對(duì)檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行病毒分離和測(cè)序,共測(cè)得28株P(guān)CV2病毒全基因組,繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。,全長(zhǎng)為1767 bp的分離株有27株,1株為1766 bp。測(cè)得的毒株分屬于PCV2b和PCV2d兩個(gè)基因亞型,屬于PCV2b亞型有7株,屬于PCV2a亞型1株;其余為PCV2d亞型。對(duì)28株P(guān)CV2 ORF2編碼氨基酸序列比對(duì)分析表明,PCV2基因型及亞型具有其特異的氨基酸變異位點(diǎn)。而2015-2016年間在江蘇部分地區(qū)的PCV2流行毒株主要為PCV2d亞型。研究2.豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)分離株致病性研究為了解當(dāng)前流行的PCV2d毒株的致病性,從分離株中挑選151107 YZ株和160924 YC株作動(dòng)物致病性實(shí)驗(yàn)。首先,用本室的Dulac細(xì)胞對(duì)上述分離株分離并盲傳,讓病毒適應(yīng)細(xì)胞且達(dá)到較高滴度。取盲傳第3代、第7代、第10代的病毒液提取DNA用PCR檢測(cè)和測(cè)定TCID50可以發(fā)現(xiàn)隨著傳代次數(shù)的增加病毒滴度逐漸上升,并在10代左右達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。將PCV2抗體陰性豬隨機(jī)分為3組:健康對(duì)照組2頭;感染151107 YZ組3頭;感染160924 YC組3頭。接種后第3、7、10、14、17、21 d采集血樣檢測(cè)PCV2的抗體和DNA水平;攻毒后21 d撲殺所有試驗(yàn)豬,并采集樣品制作病理切片。結(jié)果表明:PCV2分離株可適應(yīng)Dulac細(xì)胞并可穩(wěn)定地增殖。IFA試驗(yàn)結(jié)果顯示,選取的兩個(gè)分離株TCID50值均可達(dá)到106.0/mL以上。在人工感染試驗(yàn)中,試驗(yàn)組在攻毒后第7 d均出現(xiàn)病毒血癥且PCV2的病毒核酸載量也達(dá)到高峰。組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示,攻毒豬均出現(xiàn)由PCV2引起的不同程度病理?yè)p傷。
【圖文】：

板以及ＰＲＲＳＶ與ＣＳＦＶ經(jīng)ＲＴ－ＰＣＲ得到的ｃＤＮＡ為模板，ＰＣＲ擴(kuò)增出６條特異性條帶，逡逑條帶對(duì)應(yīng)大小分別為邋６８５邋ｂｐ、５６９ｂｐ、５１１邋ｂｐ、２７７邋ｂｐ、３７７ｂｐ、２８８邋ｂｐ邋（圖邋１－１）。用邋ＰＣＶ２逡逑特異性檢測(cè)引物對(duì)分離株進(jìn)行ＰＣＲ檢測(cè)可以擴(kuò)增出５６９ｂｐ特異性條帶（

５００邋ｂｐ逡逑４００邋ｂｐ逡逑圖１－２邋ＰＣＶ２分離株ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果逡逑Ｍ：邋１００邋ｂｐ邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ邋１邋？１１：邋ＰＣＶ２邋分離株邋１２：邋Ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋１３：邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑３．２邋ＰＣＶ２全基因組的分段測(cè)序與拼接逡逑將鑒定為陽(yáng)性的病料樣品０．２２邋ｐｍ濾器除菌后接種于Ｄｕｌａｃ細(xì)胞，盲傳３代后反復(fù)凍逡逑融細(xì)胞３次，，吸取５００吣細(xì)胞上清提�。模危痢Ｍㄟ^(guò)四段測(cè)序引物ＰＣＲ分段擴(kuò)增ＰＣＶ２逡逑每段基因組，將ＰＣＲ擴(kuò)增出來(lái)４條特異性的條帶經(jīng)１％瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確的條帶送逡逑至南京金斯瑞生物有限公司測(cè)序，將測(cè)序完成的四段序列拼接出ＰＣＶ２的全基因組序列。逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S858.28

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2541370