【摘要】：5-HT被認(rèn)為是一種反饋性抑制泌乳和誘導(dǎo)乳腺退化的關(guān)鍵因子,但是其對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖凋亡的影響及機(jī)制尚不明確。奶牛乳腺表達(dá)多種亞型的5-HT受體(HTR1B,2A,2B,4和7),選擇性阻斷HTR1B和HTR2A引起乳蛋白表達(dá)量升高,但其作用機(jī)制目前亦未見(jiàn)報(bào)道。本研究以奶牛乳腺上皮細(xì)胞(MAC-T細(xì)胞系)為模型,明確5-HT對(duì)細(xì)胞增殖凋亡的影響,初步探明其作用機(jī)制,并探尋5-HT調(diào)控乳蛋白合成的信號(hào)通路。首先對(duì)MAC-T細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)及鑒定。觀察其形態(tài)為“cobblestone”結(jié)構(gòu),生長(zhǎng)曲線呈“S”形,反復(fù)傳代和凍存,細(xì)胞形態(tài)、功能穩(wěn)定并保持旺盛增殖活力,并表達(dá)上皮細(xì)胞骨架蛋白—角蛋白18。用PRL和INS處理,在mRNA和蛋白水平均檢測(cè)到酪蛋白的表達(dá)。利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)到5-HT合成限速酶TPH1,以及1B、2A、2B、4、7、5A、3A、1F、1D、2C、1E、1A等多種亞型5-HT受體的表達(dá),表明MAC-T細(xì)胞為具有分泌活性的奶牛乳腺上皮細(xì)胞,能夠合成5-HT并表達(dá)多種亞型的5-HT受體,適合作為本研究的模型。為明確5-HT對(duì)MAC-T細(xì)胞增殖與凋亡的影響,本試驗(yàn)用不同濃度5-HT處理MAC-T細(xì)胞12h,24h,48h,72h,利用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞的增殖情況,發(fā)現(xiàn)短時(shí)間(12h,24h,48h)5-HT處理,促進(jìn)MAC-T細(xì)胞的增殖。而長(zhǎng)時(shí)間(72h)5-HT處理抑制了MAC-T細(xì)胞的增殖。選擇性5-HT2B(SB204741)、5-HT2A(Ritanserin)、5-HT4(SB204070)、5-HT7(Pimozide)、5-HT1B(SB224289)受體拮抗劑處理MAC-T細(xì)胞24h,測(cè)定細(xì)胞增殖情況,發(fā)現(xiàn)選擇性5-HT1B、4受體拮抗劑對(duì)5-HT誘導(dǎo)的MAC-T的增殖具有明顯的抑制作用。而選擇性5-HT2A、2B、7受體拮抗劑對(duì)5-HT誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞的增殖無(wú)影響。利用200μM 5-HT處理細(xì)胞72h,20μM 5-HT處理細(xì)胞24h,RT-qPCR法檢測(cè)增殖凋亡相關(guān)因子caspase3、caspase8、Bax、Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)200μM 5-HT處理細(xì)胞72h,顯著抑制Bcl-2 mRNA表達(dá),顯著提高caspase3、caspase8的m RNA表達(dá)量,并引起B(yǎng)ax/Bcl-2值升高。而20μM 5-HT處理MAC-T 24 h,Bax/Bcl-2的值與對(duì)照組相比降低,caspase3 mRNA表達(dá)量顯著降低。這些結(jié)果提示5-HT可通過(guò)改變Bax/Bcl-2的比值以及caspase3、caspase8的表達(dá)量來(lái)調(diào)控細(xì)胞的命運(yùn)。為探尋5-HT調(diào)控酪蛋白合成的信號(hào)通路,本試驗(yàn)利用20μM 5-HT處理細(xì)胞48h,RT-qPCR法測(cè)定參與乳蛋白合成調(diào)節(jié)過(guò)程中的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子JAK2、STAT5、m TOR、rpS6K1、4EBP1、eIF4E的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),5-HT處理后STAT5的表達(dá)顯著降低,JAK2有降低的趨勢(shì)。但4EBP1、eIF4E、eEF2、mTOR、rpS6Kl mRNA的相對(duì)表達(dá)量均不受影響。這提示JAK2-STAT5信號(hào)通路參與5-HT對(duì)酪蛋白合成的調(diào)控過(guò)程。總之,低濃度短時(shí)間5-HT處理可以促進(jìn)MAC-T的增殖,高濃度長(zhǎng)時(shí)間5-HT處理抑制MAC-T的增殖。5-HT對(duì)MAC-T增殖的誘導(dǎo)作用是通過(guò)1B、4亞型受體,而非2A、2B和7受體來(lái)實(shí)現(xiàn)的。5-HT可通過(guò)改變caspase3、caspase8表達(dá)、Bax/Bcl-2的值來(lái)調(diào)控細(xì)胞的增殖凋亡。JAK2-STAT5信號(hào)通路參與5-HT對(duì)酪蛋白合成的調(diào)控過(guò)程。而在MAC-T細(xì)胞中,mTOR信號(hào)通路不參與5-HT功能的調(diào)控。
【圖文】：

標(biāo)(Yamaguchi & Hayashi,1978)。外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的 5-HT 生物合獨(dú)立進(jìn)行的。由于血腦屏障的作用，血液中5-HT很難進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，，而5-過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)(Rahman et al,1982)，因而成為中樞神經(jīng)系統(tǒng) 5-HT 合成的物質(zhì)。其代謝途徑見(jiàn)下圖：

圖 2 RT-qPCR 反應(yīng)程序Figure 2 Reaction process of RT-qPCR表 2 PCR 體系表Table 2 Composition of PCR system
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S823

【共引文獻(xiàn)】

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1 泰東梅;劉紅云;茅慧玲;汪海峰;王

本文編號(hào)：2541359