【摘要】：首先對疑似犬細(xì)小病毒(CPV)感染的病犬糞便進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增,經(jīng)目的片段測序分析,初步證明為CPV感染。將該病犬糞便處理物接種F81細(xì)胞,自第3代起,細(xì)胞出現(xiàn)典型CPE。對該株病毒進(jìn)行電鏡觀察、理化特性試驗、HA-HI及基因型等方面鑒定,證明該分離株為CPV,命名為CPV/BJ-L1株。該分離株的血凝效價為1∶512,其血凝性能被特異性抗體抑制;Reed-Muench法測定分離株病毒TCID_(50)為10-5.15/0.1 mL;電鏡觀察可見25nm左右的病毒顆粒;動物回歸試驗顯示,攻毒犬能復(fù)制出CPV的典型臨床癥狀和病理變化;對分離株的全基因組(包含兩端完整的發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列)進(jìn)行克隆、測序與分析。結(jié)果表明,BJ-L1為CPV-2a亞型,與GenBank中的21株CPV全基因序列核苷酸同源性為98.8%~99.8%,且與國內(nèi)近期分離毒株高度同源。對2006-2014年北京市CPV分離株VP2基因進(jìn)行序列分析,結(jié)果顯示,CPV流行株的變異具有某種時間相關(guān)性。
【圖文】：

ＰＵ１和ＰＵ２擴(kuò)增基因組５′Ｕ型結(jié)構(gòu)，所有引物均由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。表１ＣＰＶ全基因克隆引物引物名稱上游引物（５′→３′）下游引物（５′→３′）編碼區(qū)Ｐ１ＧＧＡＡＡＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＣＴＡＡＧＴＣＡＴＡＡＴＴＡＣＴＧＧＡＧＴＴＧＰ２ＴＴＧＧＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＧＧＴＡＴＧＧＴＴＧＧＴＴＰ３ＴＴＡＡＡＧＡＣＴＧＴＴＴＣＡＧＡＡＴＣＴＴＡＴＧＧＴＡＡＧＧＴＴＡＧＴＴＣＡＣ３′ＹＰＹ１ＡＴＴＣＴＴＴＡＧＡＡＣＣＡＡＣＴＧＡＣＣＡＡＣＡＧＣＧＣＧＣＧＴＣＡＴＣＡＣＧＴＣＡＴＰＹ２ＧＣＴＧＣＧＣＧＣＧＣＴＧＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＣＧＣＣＣＡＣＡＡＴＴＡＧＣＣＣＧ５′ＵＰＵ１ＧＡＡＣＴＡＡＣＣＴＴＡＣＣＡＴＡＡＧＴＡＣＧＴＡＧＣＧＧＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴＴＡＡＧＣＡＰＵ２ＣＴＡＣＧＣＧＧＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴＴＡＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＧＴＣＴＴＴＡＡＧＧＧＧＧＧ１．１２．２病毒ＤＮＡ提取取１００μＬ病毒樣品，按照ＤＮＡ提取試劑盒說明書提取ＤＮＡ。１．１２．３病毒全基因的克隆與測序病毒編碼區(qū)反應(yīng)體系為２５μＬ：模板ＤＮＡ２μＬ，２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＣＢｕｆｆｅｒ１２．５μＬ，ｄＮＴＰ２．０μＬ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ），上下游引物各０．５μＬ（１０μｍｏｌ／Ｌ），ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．５μＬ（２．５Ｕ／μＬ），ｄｄＨ２Ｏ７．０μＬ。９８℃５ｍｉｎ；９８℃１０ｓ，，５５℃２０ｓ，７２℃２ｍｉｎ，共３０個循環(huán)；最后７２℃１０ｍｉｎ。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)

圖３電鏡下病毒粒子形態(tài)２．３病毒ＨＡ－ＨＩ試驗結(jié)果ＣＰＶ／ＢＪ－Ｌ１株第５代病毒的血凝效價為１∶５１２。ＨＩ試驗結(jié)果顯示，病毒對１％豬紅細(xì)胞的凝集特性可被ＣＰＶ單克隆抗體抑制。２．４病毒ＴＣＩＤ５０的測定結(jié)果按Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法計算ＣＰＶ／ＢＪ－Ｌ１株病毒的ＴＣＩＤ５０為１０－５．１５／０１．ｍＬ。２．５病毒理化試驗結(jié)果用５－ＢＵＤＲ處理過的ＣＰＶ的ＴＣＩＤ５０為１０－１．８５／０．１ｍＬ為比對照組低２．３個數(shù)量級，說明５－ＢＵＤＲ可明顯抑制ＣＰＶ增殖。經(jīng)乙醚、酸（ｐＨ＝３．０）、加熱處理后，病毒的ＴＣＩＤ５０無明顯變化，經(jīng)過處理的與未經(jīng)處理的病毒的ＴＣＩＤ５０相差均小于１個數(shù)量級，說明分離到的病毒對有機(jī)溶劑、熱和酸有較強(qiáng)的抵抗力，這與ＣＰＶ理化特性一致。２．６動物回歸試驗結(jié)果２只犬分別在攻毒后第４，６天開始表現(xiàn)食欲減退，精神沉郁，腹瀉，血便（圖４），體溫并無明顯升高。第７，９天先后死亡，剖檢后可見空腸、回腸彌散性出血、腫脹，腸黏膜脫落，腸腔內(nèi)充滿血樣糞便（圖５），而對照組２只犬沒有表現(xiàn)任何臨床癥狀，結(jié)果證明本試驗分離株ＢＪ－Ｌ１為強(qiáng)毒株。圖４攻毒第６天血便圖５剖檢后腸道病變２．７病毒全基因組克隆結(jié)果及序列分析ＣＰＶ／ＢＪ－Ｌ１株全基因ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果如圖６，７所示，ＢＪ－Ｌ１序列總長為５０５６ｂｐ，其中３′Ｙ型結(jié)構(gòu)全長１２０ｂｐ，５′Ｕ型結(jié)構(gòu)全長１８８ｂｐ；ＯＲＦ１全長２００７ｂｐ
【作者單位】： 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室;
【基金】：國家863計劃資助項目(2011AA10A213)
【分類號】：S852.655

【參考文獻(xiàn)】

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1 王建科;劉輝哲;林鵬;趙航;程悅寧;張淼;郭利;朱洪偉;武華;程世鵬;;犬細(xì)小病毒新2b型分離株的分離鑒定[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2016年05期

2 姜燕霞;張淑玲;王金良;申識川;;犬細(xì)小病毒JN株的分離鑒定及VP2基因序列分析[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2013年05期

3 趙建軍;閆喜軍;吳威;;犬細(xì)小病毒:從起源到進(jìn)化[J];微生物學(xué)報;2011年07期

4 史利軍;曾妮;李剛;;犬細(xì)小病毒生物學(xué)特征及檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年04期

5 劉維全,范泉水,江禹,夏咸柱,黃耕,王吉貴,房金波,王蕾;肉食獸細(xì)小病毒通用PCR診斷技術(shù)的建立[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2001年03期

6 徐漢坤,金淮,郭寶發(fā),賴杰;某犬群爆發(fā)犬病毒性腸炎的流行病學(xué)和臨床病理學(xué)觀察[J];畜牧與獸醫(yī);1983年05期

【共引文獻(xiàn)】

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1 于永樂;王吉貴;郗冀;毛亞萍;侯薔;張曉梅;劉維全;;犬細(xì)小病毒北京分離株的鑒定及其全基因組序列分析[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2017年06期

2 俞向前;文德亮;張忠海;瞿佩雯;陳亮;瞿文學(xué);潘世友;任進(jìn)文;葉承榮;;浦東新區(qū)犬細(xì)小病毒病流行情況調(diào)查[J];上海畜牧獸醫(yī)通訊;2017年02期

3 陳強(qiáng);嵇辛勤;段志強(qiáng);阮涌;雷云;龍丹丹;胡焱;萬彪;;貴陽地區(qū)犬細(xì)小病毒VP2基因的克隆及遺傳進(jìn)化分析[J];中國畜牧獸醫(yī);2017年04期

4 李同義;劉潔;王建堂;李朝軍;仝宗喜;;幼齡貓科動物犬細(xì)小病毒病的診斷[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2017年06期

5 李文莉;;犬細(xì)小病毒病的臨床癥狀和防治體會[J];畜禽業(yè);2016年11期

6 諸葛文娟;孫旭東;孫海娟;;犬細(xì)小病毒病的防制[J];養(yǎng)殖與飼料;2016年10期

7 馬輝;權(quán)國輝;喬宏興;鄭鳴;趙緒永;王永芬;邊傳周;;犬細(xì)小病毒單克隆抗體的制備及其在膠體金免疫層析試紙研發(fā)中的應(yīng)用[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2016年09期

8 金麗蘭;高旭;張立媛;宋爽;魯承;;犬細(xì)小病毒及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J];吉林畜牧獸醫(yī);2016年09期

9 胡楠;鄒翔宇;蔡錦順;;犬細(xì)小病毒研究進(jìn)展[J];吉林畜牧獸醫(yī);2016年08期

10 唐井玉;李傳峰;戚偉強(qiáng);賈仿闊;陳宗艷;王權(quán);王桂軍;劉光清;;犬細(xì)小病毒SH14株的分離鑒定及其VP2基因的序列分析[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2015年11期

【二級參考文獻(xiàn)】

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1 趙國星;王化磊;金宏麗;李倩;鄭學(xué)星;馮娜;李嶺;李露;王超;趙永坤;王鐵成;高玉偉;楊松濤;夏咸柱;;犬細(xì)小病毒抗體間接ELISA檢測方法的建立[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2014年09期

2 韓燕;朱玲;周遠(yuǎn)成;廖春燕;徐志文;郭萬柱;;犬細(xì)小病毒四川株的分離鑒定與一步生長曲線的測定[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2014年03期

3 趙桂秀;王冰;韓小蕾;;犬細(xì)小病毒病的診斷及不同年齡治愈率的效果觀察[J];畜禽業(yè);2012年10期

4 孫寧;;犬細(xì)小病毒自家滅活疫苗的血凝抑制抗體測定[J];浙江畜牧獸醫(yī);2012年04期

5 肖博仁;羅維;劉崇靈;李潤成;余興龍;;長沙9個犬細(xì)小病毒毒株的分離與鑒定[J];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2012年03期

6 王建科;易立;許紅麗;楊莘;程悅寧;程世鵬;武華;閆喜軍;;水貂腸炎病毒LN-10分離株的分離鑒定[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;2012年06期

7 馬輝;趙緒永;;犬細(xì)小病毒VP2主要抗原表位區(qū)的原核表達(dá)載體構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)[J];鄭州牧業(yè)工程高等專科學(xué)校學(xué)報;2012年02期

8 梁璐琪;張恒;魏勝男;李思琪;舒龍;鐘志軍;符華林;曹隨忠;胡延春;余樹民;李成軍;陳英;李萬清;彭廣能;;藏獒源犬細(xì)小病毒的分離鑒定[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2012年02期

9 李潤;李寧;印春生;薛青紅;支海兵;;犬細(xì)小病毒DD株的分離鑒定和VP2基因序列分析[J];中國獸藥雜志;2011年10期

10 畢峻龍;毛愛國;楊貴樹;楊斯涵;孫旭;尹革芬;;一株犬細(xì)小病毒云南毒株生物學(xué)特性分析[J];中國畜牧獸醫(yī);2011年07期

【相似文獻(xiàn)】

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1 徐銘;一起犬細(xì)小病毒性腸炎的診治[J];上海實驗動物科學(xué);2002年03期

2 邵偉娟;謝建云;胡建華;高誠;;犬細(xì)小病毒核酸診斷方法的建立和應(yīng)用[J];中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2006年01期

3 徐鈺;劉劍郁;解林紅;彭鵬;;犬細(xì)小病毒診斷與防制研究進(jìn)展[J];四川動物;2013年03期

4 徐瑞玲;張三思;程鴻;夏咸柱;;犬細(xì)小病毒的分離與鑒定[J];上海實驗動物科學(xué);1991年03期

5 王玉蓮,宋景成,趙翠山,白桂梅,賈淑榮;犬細(xì)小病毒的防治報告[J];黑河科技;2000年01期

6 秦建瓊,李堯清,田英;生脈注射液在犬細(xì)小病毒癥治療中的應(yīng)用[J];四川動物;2001年01期

7 李秋禾;;認(rèn)識犬細(xì)小病毒[J];當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè);2006年06期

8 張考;靳慧君;仲飛;李秀錦;能昌愛;陳慧慧;李文艷;溫潔霞;;腺病毒介導(dǎo)犬干擾素-γ基因的表達(dá)及其體外抗犬細(xì)小病毒的作用[J];微生物學(xué)報;2012年11期

9 渠川玫;彭傳貴;吳建華;郭淑杰;徐在海;李德榮;梁士哲;范文光;王振山;左小剛;;犬細(xì)小病毒在乳貓腎細(xì)胞內(nèi)生長動態(tài)觀察[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;1986年06期

10 陳國燦,錢志堅,聶金榮;犬細(xì)小病毒抗體在該病毒感染的診斷與防治中的應(yīng)用[J];上海實驗動物科學(xué);1996年Z1期

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1 劉巧榮;陳西釗;田克恭;;犬細(xì)小病毒單克隆抗體在治療犬細(xì)小病毒病中的臨床應(yīng)用[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會小動物醫(yī)學(xué)分會第四次學(xué)術(shù)研討會、中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)外科學(xué)分會第十六次學(xué)術(shù)研討會論文集（2）[C];2009年

2 范國英;鐘華;陳俊杰;劉俊偉;;犬細(xì)小病毒伴氧氟沙星中毒的治療[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜內(nèi)科學(xué)分會2009年學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2009年

3 崔水保;郭建平;;犬細(xì)小病毒三種接毒方法的比較研究[A];第四屆中國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2001年

4 劉劍郁;;犬細(xì)小病毒診斷研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會養(yǎng)犬學(xué)分會第十二次全國養(yǎng)犬學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2007年

5 黃維;;犬細(xì)小病毒腸炎的臨床研究進(jìn)展[A];第十三次全國養(yǎng)犬學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2009年

6 文翼平;;犬細(xì)小病毒單克隆抗體對犬細(xì)小病毒病的臨床應(yīng)用研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2010年學(xué)術(shù)年會——第二屆中國獸醫(yī)臨床大會論文集(上冊)[C];2010年

7 李穎;楊秀勇;王傳彬;陳西釗;王宏偉;田克恭;;犬細(xì)小病毒IgG抗體ELISA檢測試劑盒的研制與應(yīng)用[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2003年學(xué)術(shù)年會論文集（小動物醫(yī)學(xué)分冊）[C];2003年

8 劉劍郁;;犬細(xì)小病毒免疫診斷技術(shù)[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會養(yǎng)犬學(xué)分會第十二次全國養(yǎng)犬學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2007年

9 宮江;;犬細(xì)小病毒的防治[A];吉林省畜牧獸醫(yī)學(xué)會2007學(xué)術(shù)年會論文集[C];2007年

10 劉建和;;犬細(xì)小病毒的診治[A];2009新華杯迎國慶60周年畜牧獸醫(yī)科技論文集[C];2009年

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1 ;做好犬細(xì)小病毒的防治[N];中國畜牧水產(chǎn)報;2001年

2 佚名;阿托品治療犬細(xì)小病毒效果好[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2008年

3 金昊;家犬常見病防治（下）[N];江蘇科技報;2001年

4 何更田;犬細(xì)小病毒性腸炎的診治[N];中國畜牧水產(chǎn)報;2001年

5 王紅萍;肉用狗異地引種六注意[N];山西科技報;2004年

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1 易立;犬瘟熱病毒N蛋白單克隆抗體的制備和特性研究及犬細(xì)小病毒VP2基因變異分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

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1 郭偉;犬細(xì)小病毒分離鑒定及環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測方法的建立[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

2 張立媛;犬細(xì)小病毒YBYJ株的分離鑒定及VP2基因克隆與多克隆抗體的制備[D];延邊大學(xué);2015年

3 秦立得;表達(dá)密碼子優(yōu)化犬細(xì)小病毒VP2蛋白重組犬瘟熱弱毒疫苗株的構(gòu)建[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

4 張馨穎;犬細(xì)小病毒VP2基因的原核表達(dá)及鑒定[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 李月華;犬細(xì)小病毒單克隆抗體的制備與應(yīng)用[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

6 耿雨菲;2014-2015年黑龍江三個地區(qū)犬細(xì)小病毒2型的PCR檢測及其VP2基因序列分析[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2016年

7 岳進(jìn)華;大熊貓犬瘟熱和小熊貓犬細(xì)小病毒病病原調(diào)查及犬細(xì)小病毒免疫血清與疫苗的研制[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

8 衛(wèi)巧林;嵌合犬細(xì)小病毒VP2基因重組狂犬病毒的拯救與鑒定[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

9 楊麗;犬瘟熱病毒和犬細(xì)小病毒的分離與鑒定及其單克隆抗體的研制[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2016年

10 劉歡;抗犬細(xì)小病毒單鏈抗體的制備[D];河北科技師范學(xué)院;2016年

本文編號：2535227