【摘要】：驗證基于革蘭氏陽性增強基質(Gram-positive enhancer matrix,GEM)展示口蹄疫病毒細菌樣顆粒(Bacteria-like particles,BLP)疫苗的可行性。按照大腸桿菌偏好性密碼子優(yōu)化合成基于豬口蹄疫病毒Mya98株序列的3種抗原基因設計,并將其插入到含有錨鉤蛋白基因的原核表達載體p QZ-PA,鑒定陽性后轉入Escherichia coli BL21,進行誘導表達。利用SDS-PAGE與Western blotting對目的基因表達及產物的可溶性進行分析。利用GEM顆粒純化目的蛋白,制備細菌樣顆粒疫苗抗原;利用BCA試劑盒測定重組蛋白的濃度,將重組蛋白與白油佐劑乳化,制備疫苗,免疫5周齡小鼠,同時設商品化多肽苗對照與空白對照,免疫后不同時間采集試驗小鼠血清,利用口蹄疫病毒多肽ELISA抗體檢測試劑盒和O型口蹄疫抗體液相阻斷酶聯(lián)免疫(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒檢測免疫小鼠血清的抗體水平;利用噻唑藍比色法(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)測定淋巴細胞增殖情況;利用熒光定量PCR方法檢測相關細胞因子表達,評價細胞免疫水平。SDS-PAGE結果表明,設計在大腸桿菌中的3種口蹄疫病毒抗原基因均以可溶形式獲得高效表達;Western blotting結果顯示,表達的重組蛋白能夠與口蹄疫病毒陽性血清發(fā)生反應,利用GEM顆粒能夠實現(xiàn)重組蛋白的一步離心純化,制備BLP疫苗抗原;免疫試驗結果表明,設計的重組抗原B(T1BT2)4B不但能夠刺激免疫小鼠產生更高水平的多肽特異性ELISA抗體與口蹄疫特異性液相阻斷抗體,而且產生了更高水平的脾淋巴細胞增殖及Th1型的細胞因子分泌。初步實驗結果表明,本研究制備的BLP疫苗GEM-B(T1BT2)4B具有良好的免疫原性,為研究口蹄疫病毒基因工程亞單位疫苗開辟了一條新的思路。
【圖文】：

ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechFebruary25,2017Vol.33No.2http://journals.im.ac.cn/cjbcn222預期設計的目的基因片段一致。2.2重組蛋白的表達及可溶性分析鑒定正確的重組表達質粒轉化BL21感受態(tài)細，在含有氨芐青霉素的LB平上挑取單個菌落培養(yǎng)。取菌到含有氨芐青霉素的LB體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)到細菌濃度達到OD600為0.51時加終濃度為0.4mmol/L的IPTG，誘導24h后，菌離去培養(yǎng)基，用PBS重懸菌體后經高壓破碎儀破碎菌體，用SDS-PAGE檢測表達產物(圖1)，3個融合蛋白都可以表達，分子分約為47、28與36kDa，^u且3個蛋白均以可溶性形式存在于菌體破碎的上清中。圖1重組蛋白表達及可溶性分析結果Fig.1ExpressionandsolubilityidentificationoftherecombinantproteinwithSDS-PAGE.M:proteinmolecularmarker;1:blankcontrolofBL21transformedwithplasmidpQZ;2:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-B(T1BT2)4B-PA;3:supernatantofsupersonictreatedrecombinantplasmidpQZ-B(T1BT2)4B-PAtransformedBL21;4:sedimentforrecombinantplasmidpQZ-B(T1BT2)4B-PAtransformedBL21aftersupersonic;5:blankcontrolofBL21transformedwithplasmidpQZ;6:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-BT1B-PA;7:supernatantofsupersonictreatedrecombinantplasmidpQZ-BT1B-PAtransformedBL21;8:sedimentforrecombinantplasmidpQZ-BT1B-PAtransformedBL21aftersupersonic;9:blankcontrolofBL21transformedwithplasmidpQZ;10:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-BT2B-PA;11:supernatantofsupersonictreatedrecombinantplasmidpQZ-BT2B-PAtransformedBL21;12:sedimentforrecombinantplasmidpQZ-BT2B-PAtransformedBL21aftersuperson

PAtransformedBL21;8:sedimentforrecombinantplasmidpQZ-BT1B-PAtransformedBL21aftersupersonic;9:blankcontrolofBL21transformedwithplasmidpQZ;10:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-BT2B-PA;11:supernatantofsupersonictreatedrecombinantplasmidpQZ-BT2B-PAtransformedBL21;12:sedimentforrecombinantplasmidpQZ-BT2B-PAtransformedBL21aftersupersonication.2.3重組蛋白表達產物的Westernblotting鑒定經SDS-PAGE泳后，轉印至PVDF膜，用鼠抗O型FMDV肽陽性血清對表達產物徻行Westernblotting鑒定，結果如圖2所示，在PVDF膜上獲得的帶與SDS-PAGE表達的蛋白帶一致，這表明表達的重組蛋白可被特異性的抗體所識，具有較好的抗原性。2.4GEM純化目的蛋白的SDS-PAGE鑒定如圖3所示，，用SDS-PAGE可檢測到較高純度目的蛋白的存在，純化后pQZ-BT1B-PA重組蛋白濃度為85μg/mL；純化后pQZ-BT2B-PA重組蛋白濃度為213μg/mL；純化后pQZ-B(T1BT2)4B-PA重組蛋白濃度為870μg/mL；用透鏡觀察可見，與未結合前的GEM比，結合重組蛋白后的GEM顆粒有很不壝則的細成團結合物，可是蛋白形成了聚體(圖4)。圖2重組蛋白的Westernblotting鑒定結果Fig.2Westernblottinganalysisofrecombinantprotein.M:proteinmolecularmarker;1:blankcontrolofBL21transformedwithplasmidpQZ;2:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-BT1B-PA;3:supernatantofsupersonictreatedrecombinantplasmidpQZ-BT1B-PAtransformedBL21;4:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-BT2B-PA;5:supernatantofsupersonictreatedrecombinantplasmidpQZ-BT2B-PAtransformedBL21;6:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-B(T1BT2)4B-PA;7:supernatantofsupersonicated
【作者單位】： 安徽農業(yè)大學動物科技學院;國家獸用生物制品工程技術研究中心;江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心;
【基金】：公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(No.201303046) 江蘇省農業(yè)自主創(chuàng)新專項(No.CX(14)2089)資助~~
【分類號】：S852.4

【參考文獻】

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本文編號：2535095