【摘要】：豬圓環(huán)病毒二型、豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病毒、水皰性口炎病毒、豬水泡病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌以及豬胸膜肺炎放線桿菌等都是臨床上較為常見的,傳染性強(qiáng)、流行廣泛,且危害極為嚴(yán)重的豬病病原體,極大的影響并制約著我國的生豬養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展,也對社會公共衛(wèi)生安全造成了巨大的隱患。這9種疫病常以混合感染的形式出現(xiàn),臨床癥狀十分復(fù)雜,目前的檢測手段難以應(yīng)對。GenomeLab TM GeXP遺傳分析系統(tǒng)是一種新型的多基因表達(dá)定量分析平臺,將GeXP的多重PCR擴(kuò)增技術(shù)與毛細(xì)管電泳分析技術(shù)相結(jié)合,利用帶有熒光標(biāo)記的通用引物和特異性嵌合引物的聯(lián)合擴(kuò)增,使目的基因得到高效表達(dá),該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、高通量及檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)。本研究根據(jù)NCBI公布的PCV-2、CSFV、PRRSV、VSV、SVDV、TGE、M.hyo、HPS以及APP的靶基因序列,對保守區(qū)基因序列進(jìn)行分析比對,并設(shè)計(jì)9對特異性引物,利用常規(guī)PCR的單引物單模板和單引物混合模板的雙重驗(yàn)證方式,對以上引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證分析;同時利用高效的pMD19-T Simple克隆載體構(gòu)建9種陽性克隆質(zhì)粒,應(yīng)用GeXP技術(shù)進(jìn)行測序分析。結(jié)果顯示,所設(shè)計(jì)的引物均具有良好的特異性和敏感性,陽性克隆質(zhì)粒測序結(jié)果均與GenBank所中公布靶基因序列相符,同源性達(dá)到99.5%以上。將9對特異性引物其進(jìn)行優(yōu)化和修飾,設(shè)計(jì)出兩組GeXP引物:一對加有cy5熒光標(biāo)記的通用引物和9對特異性嵌合引物,并建立單重GeXP體系、初步構(gòu)建多重GeXP體系、對多重體系的特異性引物Tm值及特異性引物的含量進(jìn)行優(yōu)化,并驗(yàn)證其特異性及靈敏度。結(jié)果顯示,單重GeXP體系靈敏度可達(dá)102copies/μL,靈敏度與Lamp相當(dāng),是熒光定量PCR的1000多倍;多重GeXP體系優(yōu)化結(jié)果顯示,最優(yōu)Tm值為58.5℃,最佳特異性引物含量為上下游各0.5μL,在該反應(yīng)條件下體系對于目的片段的擴(kuò)增更加的清晰、特異、更易于的判斷,同時提高了該體系擴(kuò)增的穩(wěn)定性。對其他12種常見畜病病原體的進(jìn)行特異性驗(yàn)證時,均未發(fā)現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,從而進(jìn)一步證明該多重GeXP體系具有極高特異性;對27份臨床樣本進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示陽性率為40.7%,與實(shí)際的結(jié)果相符,證明了該多重GeXP體系具有高準(zhǔn)確性及較強(qiáng)的臨床實(shí)用價值。
【圖文】：

基因芯片技術(shù)因芯片技術(shù)是近幾年才發(fā)展起來的新型的基因檢測技術(shù)，又稱 DNA 芯片片技術(shù)的主要原理是通過雜交測序方法，利用一組已知序列的核酸探針進(jìn)來核酸序列的檢測方法。在一塊特殊處理的基片表面固定上已知序列的針[99]。并在基片上加入帶有熒光標(biāo)記的核酸序列 TATGCAATCTAG 溶液基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針反應(yīng)，從而產(chǎn)生互補(bǔ)匹配時，，就會發(fā)出熒察熒光強(qiáng)度大小，找到最強(qiáng)的探針位置，從而獲得一組序列完全互補(bǔ)的探據(jù)此序列即可重組出靶核酸的序列�；蛐酒夹g(shù)具有高通量、高靈敏性快速簡便。但是成本較為高昂，芯片的信號有范圍的，計(jì)算的表達(dá)量反應(yīng)，基因雜交也會帶來相對的誤差[100]。eXP 多重基因表達(dá)分析系統(tǒng)GeXP 系統(tǒng)的組成及原理

bTMGeXP 遺傳分析系統(tǒng)由是美國 Beckman Coulter 公多基因定量分析表達(dá)的平臺，該平臺具有多種優(yōu)點(diǎn)，量、高特異性等特點(diǎn)[101]，廣泛應(yīng)用于基因測序分析等施和配套的智能化軟件系統(tǒng)，如圖 1.1 所示，在圖左 Analyzer）設(shè)備，在圖右側(cè)的就是引物設(shè)計(jì)及片段分析bTMGeXP 遺傳分析系統(tǒng)反應(yīng)原理是利用一組帶有熒擴(kuò)增的目的基因設(shè)計(jì)的特異性嵌合引物[102]，在反應(yīng)進(jìn)板 DNA/cDNA 進(jìn)行少量擴(kuò)增，再結(jié)合上游嵌合引物 12 個循環(huán)后；由于初始的通用引物的濃度是遠(yuǎn)遠(yuǎn)高行反應(yīng)后嵌合引物的濃度逐步減小，在 13 個循環(huán)到 通用引物開始進(jìn)行主導(dǎo)，這樣的擴(kuò)增模式使得靶基因，從而有效的克服了常規(guī)的多重 PCR 及熒光 PCR 的了結(jié)果中假陽性的產(chǎn)生，提高了檢測的準(zhǔn)確度。擴(kuò)增
【學(xué)位授予單位】：重慶理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 胡秀梅;張勇;徐邦牢;楊夢婕;王淼;張晨;李瑾;白如銀;周小棉;許文波;馬學(xué)軍;;GeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)在手足口病病原分型檢測中的應(yīng)用[J];病毒學(xué)報;2011年04期

2 何啟蓋;;主要豬病流行特點(diǎn)與防控技術(shù)[J];獸醫(yī)導(dǎo)刊;2014年11期

3 王增國;相蓮;李芳;魏曉光;吳守芝;;一種多重PCR方法快速鑒定7種常見腸道病原菌[J];疾病監(jiān)測;2013年05期

4 王立國;;豬傳染性胃腸炎的綜合防治[J];畜牧與飼料科學(xué);2014年12期

5 裴仉福;陳瑞愛;賀東生;張顯浩;唐續(xù);劉好朋;胡永浩;;規(guī)�；i場豬繁殖與呼吸綜合征病毒與副豬嗜血桿菌混合感染的診斷及防治[J];湖北畜牧獸醫(yī);2014年11期

6 黃森林;劉珍;;一例混合感染豬病的診治[J];湖北畜牧獸醫(yī);2014年08期

7 郭寶清,蔡雪暉,劉文興,柴文君,尹訓(xùn)南,翁長江,褚桂芳,劉光清;豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的研制[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;2000年04期

本文編號：2532505