【摘要】：豬圓環(huán)病毒二型、豬瘟病毒、豬藍耳病毒、水皰性口炎病毒、豬水泡病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌以及豬胸膜肺炎放線桿菌等都是臨床上較為常見的,傳染性強、流行廣泛,且危害極為嚴重的豬病病原體,極大的影響并制約著我國的生豬養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展,也對社會公共衛(wèi)生安全造成了巨大的隱患。這9種疫病常以混合感染的形式出現(xiàn),臨床癥狀十分復雜,目前的檢測手段難以應對。GenomeLab TM GeXP遺傳分析系統(tǒng)是一種新型的多基因表達定量分析平臺,將GeXP的多重PCR擴增技術(shù)與毛細管電泳分析技術(shù)相結(jié)合,利用帶有熒光標記的通用引物和特異性嵌合引物的聯(lián)合擴增,使目的基因得到高效表達,該技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、高通量及檢測速度快等優(yōu)點。本研究根據(jù)NCBI公布的PCV-2、CSFV、PRRSV、VSV、SVDV、TGE、M.hyo、HPS以及APP的靶基因序列,對保守區(qū)基因序列進行分析比對,并設(shè)計9對特異性引物,利用常規(guī)PCR的單引物單模板和單引物混合模板的雙重驗證方式,對以上引物進行特異性驗證分析;同時利用高效的pMD19-T Simple克隆載體構(gòu)建9種陽性克隆質(zhì)粒,應用GeXP技術(shù)進行測序分析。結(jié)果顯示,所設(shè)計的引物均具有良好的特異性和敏感性,陽性克隆質(zhì)粒測序結(jié)果均與GenBank所中公布靶基因序列相符,同源性達到99.5%以上。將9對特異性引物其進行優(yōu)化和修飾,設(shè)計出兩組GeXP引物:一對加有cy5熒光標記的通用引物和9對特異性嵌合引物,并建立單重GeXP體系、初步構(gòu)建多重GeXP體系、對多重體系的特異性引物Tm值及特異性引物的含量進行優(yōu)化,并驗證其特異性及靈敏度。結(jié)果顯示,單重GeXP體系靈敏度可達102copies/μL,靈敏度與Lamp相當,是熒光定量PCR的1000多倍;多重GeXP體系優(yōu)化結(jié)果顯示,最優(yōu)Tm值為58.5℃,最佳特異性引物含量為上下游各0.5μL,在該反應條件下體系對于目的片段的擴增更加的清晰、特異、更易于的判斷,同時提高了該體系擴增的穩(wěn)定性。對其他12種常見畜病病原體的進行特異性驗證時,均未發(fā)現(xiàn)非特異性擴增,從而進一步證明該多重GeXP體系具有極高特異性;對27份臨床樣本進行檢測,結(jié)果顯示陽性率為40.7%,與實際的結(jié)果相符,證明了該多重GeXP體系具有高準確性及較強的臨床實用價值。
【圖文】：

基因芯片技術(shù)因芯片技術(shù)是近幾年才發(fā)展起來的新型的基因檢測技術(shù)，又稱 DNA 芯片片技術(shù)的主要原理是通過雜交測序方法，利用一組已知序列的核酸探針進來核酸序列的檢測方法。在一塊特殊處理的基片表面固定上已知序列的針[99]。并在基片上加入帶有熒光標記的核酸序列 TATGCAATCTAG 溶液基因芯片上對應位置的核酸探針反應，從而產(chǎn)生互補匹配時，，就會發(fā)出熒察熒光強度大小，找到最強的探針位置，從而獲得一組序列完全互補的探據(jù)此序列即可重組出靶核酸的序列�；蛐酒夹g(shù)具有高通量、高靈敏性快速簡便。但是成本較為高昂，芯片的信號有范圍的，計算的表達量反應，基因雜交也會帶來相對的誤差[100]。eXP 多重基因表達分析系統(tǒng)GeXP 系統(tǒng)的組成及原理

bTMGeXP 遺傳分析系統(tǒng)由是美國 Beckman Coulter 公多基因定量分析表達的平臺，該平臺具有多種優(yōu)點，量、高特異性等特點[101]，廣泛應用于基因測序分析等施和配套的智能化軟件系統(tǒng)，如圖 1.1 所示，在圖左 Analyzer）設(shè)備，在圖右側(cè)的就是引物設(shè)計及片段分析bTMGeXP 遺傳分析系統(tǒng)反應原理是利用一組帶有熒擴增的目的基因設(shè)計的特異性嵌合引物[102]，在反應進板 DNA/cDNA 進行少量擴增，再結(jié)合上游嵌合引物 12 個循環(huán)后；由于初始的通用引物的濃度是遠遠高行反應后嵌合引物的濃度逐步減小，在 13 個循環(huán)到 通用引物開始進行主導，這樣的擴增模式使得靶基因，從而有效的克服了常規(guī)的多重 PCR 及熒光 PCR 的了結(jié)果中假陽性的產(chǎn)生，提高了檢測的準確度。擴增
【學位授予單位】：重慶理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 胡秀梅;張勇;徐邦牢;楊夢婕;王淼;張晨;李瑾;白如銀;周小棉;許文波;馬學軍;;GeXP多重基因表達遺傳分析系統(tǒng)在手足口病病原分型檢測中的應用[J];病毒學報;2011年04期

2 何啟蓋;;主要豬病流行特點與防控技術(shù)[J];獸醫(yī)導刊;2014年11期

3 王增國;相蓮;李芳;魏曉光;吳守芝;;一種多重PCR方法快速鑒定7種常見腸道病原菌[J];疾病監(jiān)測;2013年05期

4 王立國;;豬傳染性胃腸炎的綜合防治[J];畜牧與飼料科學;2014年12期

5 裴仉福;陳瑞愛;賀東生;張顯浩;唐續(xù);劉好朋;胡永浩;;規(guī)模化豬場豬繁殖與呼吸綜合征病毒與副豬嗜血桿菌混合感染的診斷及防治[J];湖北畜牧獸醫(yī);2014年11期

6 黃森林;劉珍;;一例混合感染豬病的診治[J];湖北畜牧獸醫(yī);2014年08期

7 郭寶清,蔡雪暉,劉文興,柴文君,尹訓南,翁長江,褚桂芳,劉光清;豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的研制[J];中國預防獸醫(yī)學報;2000年04期

本文編號：2532505