【摘要】：豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diahorrea Virus,PEDV)引起的豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diahorrea, PED)是嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的腸道傳染病。目前,還沒有有效的治療措施及治療藥物能對(duì)PED進(jìn)行治療�？刂坪皖A(yù)防PED的主要途徑之一是疫苗接種,但有研究表明有些豬場(chǎng)在接種該疫苗后,豬群還是被PEDV感染致病并大量傳播。究其原因可能是PEDV不同毒株之前發(fā)生了比較大的變異,致使疫苗免疫失效。因此,找出更加有效地防治PED的手段具有重要意義。在生物機(jī)體內(nèi)miRNA是一類非編碼的小RNA。miRNA作用非常廣泛,能調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化以及新陳代謝和凋亡等重要的生命過程。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)具有抗病毒功能的miRNA越來越多,且miRNA發(fā)揮作用的區(qū)域可直接是病毒基因保守序列,所以miRNA對(duì)同一病毒的不同毒株都有抗病毒作用。為研究豬流行性腹瀉病毒對(duì)PK-15細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的影響,將PEDV感染PK-15細(xì)胞后,提取總RNA,進(jìn)行高通量測(cè)序,構(gòu)建感染PEDV的PK-15細(xì)胞以及未感染的細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜,并進(jìn)行差異性分析。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),有214個(gè)1niRNA顯著性差異表達(dá),其中175個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào),39個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。選取10個(gè)顯著性差異表達(dá)的miRNA通過RT-qPCR進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示RT-qPCR驗(yàn)證的各miRNA的表達(dá)趨勢(shì)與高通量測(cè)序結(jié)果一致。為研究差異表達(dá)的miRNA對(duì)病毒增殖的作用,結(jié)合靶基因預(yù)測(cè)、miRNA表達(dá)譜以及己報(bào)道與免疫有關(guān)的miRNA,本試驗(yàn)選取ssc-let-7f以及其它6個(gè)miRNA合成miRNA minics轉(zhuǎn)染到PK-15細(xì)胞中,并接種PEDV,取樣進(jìn)行熒光定量PCR,觀察轉(zhuǎn)染miRNA后PEDV病毒含量的變化,驗(yàn)證各miRNA對(duì)病毒增殖的作用。其結(jié)果顯示,ssc-let-7f在12h、24h及36h的時(shí)候均對(duì)PEDV的增殖有明顯的抑制作用。說明ssc-let-7f對(duì)PEDV的體外感染有一定的抑制作用。本試驗(yàn)是首次對(duì)PEDV感染豬腎細(xì)胞PK-15后miRNA表達(dá)譜的進(jìn)行研究,為進(jìn)一步闡明miRNA對(duì)宿主先天性免疫系統(tǒng)的分子調(diào)控機(jī)制提供依據(jù),對(duì)PED的防治提供新思路,更為進(jìn)一步揭示miRNA的抗病毒機(jī)制,miRNA與PEDV之間復(fù)雜的關(guān)系以及深入研究PEDV的致病機(jī)制提供理論參考依據(jù)。
【圖文】：

（３’邋ＵＴＲ）內(nèi)有一段序列為ＧＧＡＡＧＡＧＣ的保守序列，，其后面連著Ｐｏｌｙ（Ａ）序列，總長(zhǎng)逡逑為３３４ｎｔ，ＰＥＤＶ基因組含有６個(gè)ＯＲＦ在編碼區(qū)中，從５’到３’端分別為Ｐｏｌ基因、逡逑Ｓ基因、ＯＲＦ３基因、ｓＭ基因、Ｍ基因和Ｎ基因（如圖１－２），其中Ｓ基因、ｓＭ基因、逡逑Ｍ基因和Ｎ基因均編碼結(jié)構(gòu)蛋白，編碼的依次是纖突蛋白、小膜蛋白、膜糖蛋白和逡逑核衣殼蛋白，Ｐｏｌ基因和０ＲＦ３基因編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，編碼的依次是復(fù)制酶多聚蛋白逡逑和ＯＲＦ３蛋白Ｐ５１。逡逑Ｐｏｌ邐Ｓ邋ＯＲＦ３邋ｓＭ邋Ｍ邋Ｘ逡逑圖１－２邋ＰＥＤＶ基因的結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇ．１－２邋Ｔｈｅ邋ＰＥＤＶ邋ｔｈｅ邋ｇｅｎｅ邋ｓｔｒｕｃｔ：ｕｒｅ逡逑１．３．１邋Ｓ基因及其編碼的Ｓ蛋白逡逑Ｓ基因的長(zhǎng)度為４１５２ｎｔ，編碼纖突Ｓ（ｓｐｉｋｅ）蛋白，Ｓ蛋白由１３８３個(gè)氨基酸（ａａ）組逡逑成ＰＷ。Ｓ基因的啟動(dòng)密碼子不能啟動(dòng)蛋白質(zhì)的合成，只能用于翻譯多膚。Ｓ蛋白上逡逑３逡逑

生物學(xué)界研巧的熱口方向。逡逑２．２邋ｍｉＲＮＡ的形成逡逑如圖１－３，邋ｍｉＲＮＡ的形成是一個(gè)復(fù)雜的包含很多步驟的過程。ｍｉＲＮＡ是被更大逡逑的一類含有莖－環(huán)（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐｅ）的結(jié)構(gòu)ＲＮＡ剪切加工形成的，而這類ＲＮＡ邋—般能形逡逑成不止一個(gè)ｍｉＲＮＡ。這類較長(zhǎng)的ＲＮＡ序列被稱為ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ，經(jīng)過研究人員對(duì)這類逡逑ＲＮＡ的研巧表明，在動(dòng)植物中ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ邋—般具有較長(zhǎng)的序列，且還具有類似逡逑ＲＮＡ聚合酶ＩＩ有３＇端的ＰｏｌｙＡ尾和５＇端的帽子結(jié)構(gòu)等的轉(zhuǎn)錄特征。不僅如此，逡逑ＲＮＡ聚合酶ＩＩ的啟動(dòng)子序列還包含在ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ的上游，ｍｉＲＮＡ通過Ｍｅｆ２、ｍｙｏＤ、逡逑ＮＦＩ－Ａ等轉(zhuǎn)錄因子及一些與血清反應(yīng)的因子結(jié)合上其５＇端的ＲＮＡ聚合酶ＩＩ的啟逡逑動(dòng)子序列，則可調(diào)控ＲＮＡ聚合酶ＩＩ的啟動(dòng)子的活性，達(dá)到調(diào)節(jié)ｍｉＲＮＡ序列表達(dá)逡逑的目的ｔＷ。在動(dòng)物體內(nèi)，經(jīng)過兩次加工剪切后的ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ能形成成熟的ｍｉＲＮＡ。逡逑首先
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S858.28

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本文編號(hào)：2528188