發(fā)布時間：2019-08-17 20:24

【摘要】：拉沙里菌素(lasalocid,LAS)是由拉沙里鏈霉菌發(fā)酵產生的一種聚醚類離子載體抗生素,主要用于提高反芻動物飼料利用率和預防畜禽球蟲感染。但在實際生產中,由于LAS不合理使用,導致其在牛奶、雞蛋及動物組織中殘留超標,嚴重威脅人類的健康。目前,檢測LAS殘留的方法主要是高效液相色譜法和液相色譜質譜聯(lián)用法。然而這些傳統(tǒng)的儀器檢測不但需要昂貴的儀器設備和復雜的前處理,而且還需要專業(yè)的技術人員操作,這些因素都影響著樣品檢測的效率和準確度。ELISA檢測法是免疫學方法的一種,基于抗原抗體特異性結合的原理,具有高特異性和高靈敏性的特點,由于其檢測方法簡單、快速、高效且便于攜帶,所以適合大批量樣品的快速檢測。本實驗采用活性酯法合成LAS完全抗原,經透析、鑒定后免疫BALB/c小鼠,然后利用單克隆抗體技術、酶聯(lián)免疫吸附技術及小鼠體內誘生腹水技術,制備出針對LAS的效價高、特異性強的抗體,并以此為基礎建立間接競爭ELISA工作方法。1、LAS完全抗原的合成與鑒定LAS屬于半抗原,分子中含有羥基,采用活性酯法將分子中的羧基先與間隔臂分子中的氨基連接,形成穩(wěn)定的酰胺鍵,然后再與載體蛋白(BSA、OVA)進行偶聯(lián),使半抗原與載體蛋白之間形成一間隔臂。完全抗原經過SDS-PAGE法、紫外掃描法和免疫學方法鑒定,結果表明LAS與載體蛋白偶聯(lián)成功。采用BCA試劑盒測得LAS-BSA和LAS-OVA蛋白濃度分別為2.54 mg/mL和2.42 mg/mL。2、LAS單克隆抗體的制備以LAS-BSA為免疫原,免疫BALB/c小鼠,五免后小鼠血清效價在1:12800。采用雜交瘤技術進行脾細胞和骨髓瘤細胞的融合,采用ELISA法和有限稀釋法篩選出一株可穩(wěn)定分泌針對LAS的抗體的單克隆細胞株C11,采用小鼠體內誘生法制備了 20mL腹水,其蛋白濃度為33.39mg/mL。交叉實驗結果顯示,與莫能菌素鈉、鹽霉素鈉、馬杜霉素胺、頭孢噻吩鈉和硫酸鏈霉素均無交叉反應。3、ELISA檢測方法的建立選用C11株單克隆細胞,采用小鼠體內誘生法制備單克隆抗體,建立檢測LAS的間接競爭ELISA法。包被原和腹水的最佳工作濃度分別是1:400和1:4000,LAS濃度在5～1000 ng/mL 時,線性關系良好,線性方程為 y = 0.376x-0.2374(R2 = 0.9914),IC50 為 90.22 ng/mL,LOD 為 6.04 ng/mL。4、牛奶中LAS添加回收實驗將牛奶樣品進行前處理,結果顯示樣品處理后再用PBS稀釋8倍時可基本消除基質干擾。LAS濃度在10～1000 ng/mL時,標準曲線線性關系良好,線性方程為y = 0.4111x-0.3591(R2 = 0.9912),IC50為 121.96ng/mL,LOD 為 13.59ng/mL。用 50、500、800ng/mL的LAS標準溶液做回收實驗,回收率在81.76%～102.41%之間。
【圖文】：

１．１邐ＬＡＳ理化性質逡逑ＬＡＳ是一種無色或白色結晶性粉末，分子式為Ｃ３４Ｈ５４0８，分子量為５９０．７８，熔點逡逑１１ＣＴＣ？１１４°ＣＷ。微溶于水，可溶于大部分有機溶劑，化學結構式如圖１所示。其鈉鹽性逡逑能穩(wěn)定，３７°Ｃ下可保存６個月不變，２５°Ｃ下保存１２月不變，含量仍維持在９５％以上［９］。逡逑0ｈ３邋ｃｈＨ３３％Ｈ３？逡逑ｈ0邋丫逡逑ｈｃＡ＾邋ｏｈ邋0邐）逡逑Ｍ３ｕ邐Ｈ３Ｃ逡逑圖１邋ＬＡＳ化學結構式逡逑Ｆｉｇ邋１邋Ｔｈｅ邋ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＬＡＳ逡逑１．２邐ＬＡＳ作用機理逡逑ＬＡＳ是一種具有高親脂性的物質％，分子中含有兩個醚環(huán)和一個一元有機酸，，在溶液逡逑中分子兩端由氫鍵連接形成特殊環(huán)狀構型，分子中的羥氧、醚氧、羧酸氧基團中的氧原子逡逑組成了一個能捕獲陽離子的空洞［１（）］，分子的外部由烴類構成，具有疏水性［６，１１］。該構型分子逡逑可以與Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋等一價或二價陽離子結合，形成一種脂溶性復合物而通過生物膜，逡逑從而發(fā)揮藥理作用［１２＿１４］。逡逑

乙液：�。常靛澹恚珏澹拢樱寥苡冢叮埃敖校茫拢又�。逡逑將上述甲液沿管壁緩慢加入乙液中，邊加邊搖勻，之后３７°Ｃ攪拌過夜，具體反應過程逡逑見圖２。將反應后的液體轉移至處理好的透析袋內，兩端用透析袋夾密封后置于１邋ＬＰＢＳ溶逡逑液中４°Ｃ攪拌透析３ｄ，每天更換３次透析液，最后將透析袋內液體分裝凍存。逡逑
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S859.84

【參考文獻】

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本文編號：2528010