【摘要】：本研究利用帶有蘑菇凝素標簽的原核表達載體(pET-LsLa),將豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)M基因的胞內(nèi)區(qū)(99~227aa)插入載體,以期獲得能可溶性表達的、大量且易于純化的M蛋白。以本實驗室構(gòu)建的pET32a-PEDV(含S、M、N、ORF3基因)重組質(zhì)粒為模板,設計去除目的基因信號肽和含有酶切位點的特異性引物,經(jīng)PCR擴增得到目的基因tM,構(gòu)建原核表達載體(pLsLa-tM),將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導、SDS-PAGE檢測及蛋白純化,結(jié)果顯示,融合蛋白LsLa-tM得到了大量表達,分子質(zhì)量約為36 kD,與預期大小一致。包涵體形式產(chǎn)物通過2M乳糖親和層析純化得到純凈的目的蛋白(LsLa-tM),Western blot檢測表明,純化蛋白能保持其反應特異性。以新生乳豬增殖PEDV流行毒株ZMDZY-CH-11,通過差速離心純化,得到純化的PEDV全病毒,用吸光度測定法檢測其總蛋白含量約19 mg/mL。利用本實驗室構(gòu)建的原核表達載體pGEX-PEDV-SA,在大腸桿菌BL21(DE3)中大量表達PEDV重組GST-SA蛋白,經(jīng)GST柱親和層析純化后得到目的蛋白,Western blot檢測表明該蛋白能和豬抗PEDV陽性血清發(fā)生特異性反應。將上述純化PEDV全病毒作為免疫原,免疫BALB/c小鼠,用純化的PEDV重組M蛋白作為檢測抗原;同時,以純化的PEDV重組GST-SA蛋白作免疫原,免疫BALB/c小鼠,以純化的PEDV全病毒作檢測抗原,分別建立了檢測抗PEDV抗體的間接ELISA方法。以PEDV重組M蛋白為檢測抗原時,確定檢測ELISA的最佳工作條件為:包被抗原量為1μg/孔/100μL,包被條件為4℃過夜,封閉物為5%脫脂奶,封閉時間為1.5 h,一抗稀釋度為1:200,作用條件為37℃1.5 h;酶標二抗最佳工作濃度為1:6000;TMB顯色時間為15 min。以PEDV全病毒為檢測抗原時,最終確定ELISA的最佳工作條件為:包被抗原量為0.5625μg/孔/100μL,包被條件為37℃作用1 h后再4℃過夜;封閉物為5%脫脂奶,封閉時間為1 h;一抗稀釋度為1:3200,作用條件為37℃1.5 h;酶標二抗最佳工作濃度為1:8000;TMB顯色時間為15 min。通過常規(guī)方法進行細胞融合,用間接ELISA方法進行檢測篩選,獲得分泌抗S蛋白單抗的雜交瘤細胞孔。將其采用有限稀釋法,進行3~4次亞克隆,最終獲得3株能穩(wěn)定分泌抗PEDV變異株S蛋白單抗的雜交瘤細胞株,分別命名為2D1、1G6和2C10。單抗亞型鑒定均為IgM。間接ELISA檢測3株細胞培養(yǎng)上清中抗體效價分別為1:1600、1:800、1:800,小鼠腹水中抗體效價分別為1:6400、1:3200、1:3200。單抗特異性試驗結(jié)果顯示,所制備的3株單抗與豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病毒(PRV)及豬Ⅱ型圓環(huán)病毒(PCV2)均無交叉反應。對其中一株(2D1)雜交瘤細胞的特性進行Western blot,結(jié)果表明,該單克隆抗體能特異性識別PEDV,但不能區(qū)分PEDV流行株和PEDV CV777疫苗株。ELISA檢測中該單抗雖與PEDV流行株及PEDV CV777疫苗株全病毒都能反應,但兩者的OD值有明顯差異,因此可用作鑒別PEDV流行株和疫苗株的初步篩選試驗。采用硫氰酸鹽洗脫法測定該單抗相對親和力(Ka)為4.0 mol/L,表明該單抗有相對較高的親和力;間接免疫熒光中該單抗能識別天然病毒(PEDV CV777疫苗株)S蛋白。采用固定病毒稀釋抗體法,按照Reed-Muench法計算該單抗的中和效價1:20,表明該單抗可能不能有效地中和PEDV病毒活性。嘗試利用腹水單抗建立檢測PEDV的雙夾心間接ELISA方法,但經(jīng)各種努力最終未獲成功,具體原因還有待進一步研究。
【學位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 古洪浪;鄧勝朝;崔進;劉曉露;劉超;袁航;馬嵐;張桂紅;;豬流行性腹瀉病毒PEDV-GD12株的分離與鑒定[J];中國獸醫(yī)雜志;2013年11期

2 杜曉莉;王一成;吳潤;徐麗華;袁秀芳;李軍星;周曉麗;;2010—2013年浙江省豬流行性腹瀉病毒臨床檢測及PEDV-S基因型分析[J];浙江農(nóng)業(yè)學報;2014年03期

3 鄧祖麗穎;陳陸;;豬流行性腹瀉病毒巢式RT-PCR檢測方法的建立及應用[J];中國畜牧獸醫(yī);2014年01期

4 李寶賢;馬廣鵬;葛俊偉;李一經(jīng);;豬流行性腹瀉病毒功能性受體的鑒定[J];病毒學報;2009年03期

5 ;Cloning the Structure Genes and Expression the N Gene of Porcine Epidemic Diarrhea Virus DX[J];Virologica Sinica;2009年03期

6 田克恭;;兔胸水滲出病[J];上海實驗動物科學;1993年02期

7 喬憲鳳,熊忠良,華文君,鄭新民;PEDV膜蛋白基因RT-PCR最適反應條件的確立[J];湖北畜牧獸醫(yī);2001年01期

8 高慎陽;王s，

本文編號：2526325