【摘要】：卵母細(xì)胞體外成熟(in vitro maturation,IVM)作為現(xiàn)代生物技術(shù)如體外受精、胚胎工程、轉(zhuǎn)基因克隆等技術(shù)的基礎(chǔ),可充分利用哺乳動物卵巢表面大量的未成熟卵泡中卵母細(xì)胞,改善胚胎體外生產(chǎn)效率,有助于提高動物生產(chǎn)。但是,體外培養(yǎng)的成熟的豬卵母細(xì)胞經(jīng)體外受精以及細(xì)胞核移植后,胚胎發(fā)育都不如體內(nèi)發(fā)育成熟的卵母細(xì)胞,其培養(yǎng)體系仍待進(jìn)一步完善。WNT信號通路在進(jìn)化中高度保守,在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、干細(xì)胞維持以及胚胎發(fā)育等方面都具有重要的作用。有研究表明WNT信號在雌性性腺發(fā)育過程中扮演關(guān)鍵角色。但WNT信號通路對于豬等大型家畜卵母細(xì)胞體外成熟的作用和機(jī)理國內(nèi)外的研究很少。本研究以豬卵母細(xì)胞為研究對象,探索WNT信號通路受體Frizzleds家族在豬卵巢中的表達(dá)與定位,篩選出豬卵巢中高表達(dá)量的受體。分析Frizzleds受體家族在哺乳動物豬卵母細(xì)胞中的時序表達(dá),揭示W(wǎng)NT通路對于哺乳動物卵母細(xì)胞發(fā)育的影響。同時,通過添加小分子抑制劑WNT-C59阻斷WNT上游通路檢測其對卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響,從而為闡明豬卵母細(xì)胞體外成熟發(fā)育中WNT/Frizzleds信號通路的具體功能和機(jī)制提供參考。研究主要獲得如下結(jié)果:1.WNT通路受體家族Frizzleds在豬卵巢中的表達(dá)差異根據(jù)Gen Bank中所保存的豬的不同F(xiàn)rizzleds基因序列,本試驗運用實時定量PCR技術(shù)分析了Frizzled2-Frizzled7、Frizzled9和Frizzled10 mRNA在豬卵巢相對表達(dá)水平。結(jié)果表明,卵巢組織中Frizzleds家族mRNA表達(dá)水平順序為:Frizzled5Frizzled7Frizzled4≥Frizzled3≥Frizzled2≥Frizzled6≥Frizzled9≥Frizzled10。即Frizzled5基因表達(dá)明顯高于其他Frizzleds家族成員的表達(dá)量(p0.05)。其中,Frizzled7表達(dá)相對較高,明顯高于Frizzled9和Frizzled10(p0.05)。其他家族成員表達(dá)無明顯不同(p0.05)。Frizzled10幾乎未表達(dá)。試驗由此揭示Frizzleds家族在豬卵巢中普遍表達(dá)并篩選出家族中表達(dá)量最高的受體Frizzled5。2.Frizzled5受體在不同直徑卵泡的表達(dá)及其在豬卵巢上的定位試驗通過實時定量PCR和免疫組織化學(xué)的方法,檢測了Frizzled5基因在不同直徑大小卵泡中的表達(dá),以及Frizzled5蛋白在豬卵巢上的定位。實時定量PCR結(jié)果表明,Frizzled5在小卵泡(2 mm)中的表達(dá)量明顯低于中型卵泡(2 mm≤d≤5 mm)和大型卵泡(5 mm)(p0.05),而在中型卵泡和大型卵泡中的表達(dá)量沒有明顯的差異(p0.05)。免疫組化顯色反應(yīng)檢測豬卵巢組織中Frizzled5蛋白的定位顯示,Frizzled5蛋白在卵母細(xì)胞膜、顆粒細(xì)胞中高表達(dá),而在基質(zhì)中表達(dá)信號中等。以上結(jié)果揭示,WNT/Frizzleds信號通路可能對卵泡的發(fā)育和卵母細(xì)胞的成熟具有一定的作用。3.Frizzleds受體基因在豬卵母細(xì)胞體外成熟不同時期的表達(dá)體外分別培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞38-41 h,44-46 h,48-50 h,觀察其成熟率和卵裂率。結(jié)果表明,培養(yǎng)44-46 h時卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)質(zhì)量最好,其成熟率明顯高于培養(yǎng)38-41h和48-50h(p0.05),其卵裂率明顯高于38-41 h(p0.05),而與培養(yǎng)48-50h比較,沒有明顯差異(p0.05)。由此證明培養(yǎng)時間過短或者過長均會影響卵母細(xì)胞的體外成熟質(zhì)量。試驗采用實時定量PCR法分析Frizzled2、Frizzled3、Frizzled4、Frizzled5和Frizzled7mRNA在不同培養(yǎng)時間卵母細(xì)胞中的相對表達(dá)水平。結(jié)果顯示,Frizzleds家族mRNA表達(dá)量隨培養(yǎng)時間發(fā)生變化,且趨勢不一致。Frizzled5在體外培養(yǎng)22 h的卵母細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于培養(yǎng)0 h和培養(yǎng)44 h的表達(dá)量(p0.05)。Frizzled3在體外培養(yǎng)22h的卵母細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于0h(p0.05),但與培養(yǎng)44 h時比較,沒有明顯不同(p0.05)。Frizzled2和Frizzled4在體外培養(yǎng)44 h的卵母細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于其他兩個時期(p0.05)。Frizzled7在培養(yǎng)44 h表達(dá)量明顯低于其他兩個時期(p0.05)。Frizzleds家族基因在卵母細(xì)胞中的動態(tài)變化說明了WNT信號通路可能依賴不同的受體在卵母細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮作用。4.WNT-C59抑制劑對豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)基中添加WNT信號通路小分子抑制WNT-C59,并對卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)進(jìn)行體外培養(yǎng)。采用實時定量PCR的方法測定Frizzled5與β-catenin在WNT-C59處理前后的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,體外添加1μM WNT-C59抑制劑濃度時,明顯提高了豬卵母細(xì)胞的成熟率(80.61%±2.07%)和卵裂(61.21%±4.34%)(p0.05)。并且與對照組比較,WNT-C59處理組Frizzled5與β-catenin的mRNA表達(dá)產(chǎn)生明顯的下調(diào)(p0.05)。由此表明,WNT-C59可能通過Frizzled5下調(diào)WNT通路關(guān)鍵蛋白β-catenin的表達(dá),來促進(jìn)豬卵母細(xì)胞的體外成熟和早期胚胎發(fā)育�？傊�,試驗檢測了WNT信號通路受體Frizzleds家族在豬卵巢中的表達(dá),并篩選出表達(dá)量最高的受體Frizzled5。該基因在豬卵泡發(fā)育不同階段表達(dá)呈動態(tài)變化,在顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中高表達(dá)。表明WNT通路對于卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟具有重要的作用。Frizzleds家族在卵母細(xì)胞不同發(fā)育時期差異性表達(dá),揭示了WNT信號通路可能依賴不同的受體在卵母細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮作用。體外添加1μM的WNT信號抑制劑WNT-C59可下調(diào)Frizzled受體和關(guān)鍵蛋白β-catenin的表達(dá),進(jìn)而有效促進(jìn)卵丘的擴(kuò)散和豬卵母細(xì)胞的體外成熟,并提高其早期胚胎發(fā)育能力。
【圖文】：

圖 2-1 經(jīng)典 WNT 信號通路原理模式圖Figure2-1 Schematic representation of the canonical WNT pathwayA.當(dāng) WNT 配體不存在時，β-catenin 與其他蛋白形成 Axin/APC/CK1/GSK3 破壞復(fù)合體并被化，被磷酸化標(biāo)記的 β-catenin 被泛素化并降解；B.當(dāng) WNT 配體存在時，，與受體形NT/Frizzled/LRP 復(fù)合體并募集 Dvl 蛋白，使 Axin/APC/CK1/GSK3 破壞復(fù)合體不能形成，阻

圖 2.2 WNT 非經(jīng)典通路模式圖Figure 2.2 Non-canonical WNT signaling pathwayPCP 通路可以激活 RhoA/Rac 介導(dǎo)的 JNK 激酶；另外，WNT/ca2+通路可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離的提升，激活鈣素依賴激酶（CAMK）和蛋白激酶 C（PKC）等酶。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S828

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2525825