【摘要】：奶牛乳腺炎和乳腺纖維化是奶牛的最常見的疾病之一,在國內外均有較高的發(fā)病率和感染率,嚴重時可發(fā)展為乳腺硬化導致奶牛淘汰,給奶牛業(yè)造成嚴重的經濟損失。奶牛乳腺纖維化通常由久治不愈的乳腺炎遷延所致,不同的病原菌引起的臨床型和隱型乳腺炎均可引起乳腺不同程度的纖維化。結締組織的過度增生、細胞外基質蛋白(extracellular matrix protein,ECM)堆積及上皮細胞間質樣轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)均可參與多種組織器官的纖維化過程。雖然大量研究已證明轉化生長因子1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)與多種器官和組織的慢性炎癥及由此產生的EMT有密切關系,但TGF-β1在奶牛乳腺纖維化中是否發(fā)揮功能及其作用機制尚不明確,本研究旨在探究TGF-β1在奶牛乳腺纖維化發(fā)生過程中的作用及其機制。本研究首先通過蛋白印跡技術(western blot)檢測發(fā)現(xiàn)TGF-β1在炎性奶牛乳腺組織中的蛋白表達水平明顯高于正常乳腺組織;酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和western blot檢測進一步發(fā)現(xiàn)TGF-β1在脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)和脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)誘導的炎性乳腺上皮細胞中的分泌和蛋白表達水平均高于正常乳腺上皮細胞,表明TGF-β1參與在奶牛乳腺的炎性應答過程。為了探究TGF-β1在奶牛乳腺炎及乳腺纖維化過程中的作用,本研究選用外源性TGF-β1處理奶牛乳腺上皮細胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs),通過一系列分子生物學方法研究其對BMECs的生物學功能的影響。本研究首先通過相差顯微鏡和F-actin熒光染色對細胞形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn),TGF-β1可誘導BMECs發(fā)生EMT;進一步通過western blot,實時熒光定量PCR,細胞免疫熒光等技術對BMECs中EMT標志分子如α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、E-鈣黏素、波形蛋白、纖連蛋白和ECM蛋白包括I型膠原蛋白、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2和MMP9等從基因和蛋白水平進行了檢測,結果發(fā)現(xiàn),TGF-β1處理BMECs促進α-SMA和波形蛋白等的表達,但抑制E鈣粘素的表達。此外,TGF-β1可促進I型膠原蛋白、MMP2、和MMP9等ECM蛋白的表達,表明TGF-β1可誘導BMECs發(fā)生明顯的EMT及ECM蛋白的過度表達。隨后,本研究通過western blot及細胞免疫熒光等實驗對TGF-β1誘導BMECs發(fā)生EMT的分子機制進行研究,結果發(fā)現(xiàn),TGF-β1處理BMECs可激活Smad2,并導致Smad4從胞質移位到胞核中,表明TGF-β1處理激活BMECs內的TGF/Smad信號通路。TGF-β1受體抑制劑能夠抑制該通路的激活,而且TGF-β1誘導BMECs發(fā)生的EMT和ECM蛋白積累同時受到抑制,表明TGF-β1通過TGF/Smad信號通路參與其誘導的上皮細胞EMT和ECM蛋白累積,進而參奶牛乳腺炎遷延導致的乳腺纖維化過程。最后,通過小鼠模型對TGF-β1可能導致的乳腺纖維化進行體內研究。病理組織切片分析發(fā)現(xiàn),小鼠乳腺導管每3天注射1次TGF-β1,共4次注射后可誘導小鼠乳腺發(fā)生明顯的炎性浸潤及不同程度的組織纖維化;經單次注射和對照組的小鼠乳腺均未見異常。結果表明,TGF-β1持續(xù)刺激可誘導乳腺發(fā)生炎癥并伴隨纖維化的發(fā)生。綜上所述,TGF-β1在炎性奶牛乳腺組織和體外誘導的炎性乳腺上皮細胞中的表達水平均明顯增高,高表達的TGF-β1可通過TGF/Smad信號通路誘導乳腺上皮細胞發(fā)生間質樣轉化及ECM蛋白生成的增加,進而參與奶牛乳腺炎遷延不愈導致的乳腺纖維化過程。
【圖文】：

MT 是另一種形式的轉分化，是脊椎動物胚胎發(fā)育時期一種被廣泛認同的細胞(Hay 1995)。組織損傷修復中成纖維細胞的生成(Strutz et al. 1995)(Iwano e、 上 皮 癌 中 癌 細 胞 的 轉 移 都 與 之 相 關 (Kiemer et al. 2001)(Janda etVincent-Salomon et al. 2003)(Xue et al. 2003)�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的 EMT 現(xiàn)象包括視網膜轉化為晶狀體上皮細胞(Eguchi et al. 1993)(Del et al. 2003)、白色脂肪細胞轉化肪細胞(Cinti 2002)、內皮細胞轉化為血管平滑肌細胞(Frid et al. 2002)。從最純講，一個終末分化上皮細胞的 EMT 產生一個組織成纖維細胞(Iwano et al. 200

β 家族是通過與一個由 I 型受體和 II 型受體構成的跨膜受體復合物結合號傳遞。家族內的不同配體有與其匹配的特定受體復合物，均由不同 II 型受體構成。脊椎動物中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)七種 I 型受體與五種 II 型受體(M些受體具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，與配體結合后刺激受體復合物形氨酸和絲氨酸富集區(qū)在 II 型受體作用下發(fā)生磷酸化(De 2004)激活，TGF-β 信號通路的胞內調控受體 R-Smad（receptor-regulated S磷酸化(Graff et al. 1996; Hoodless et al. 1996; Liu et al. 1996; Zhang et a2、Smad3。隨后磷酸化 R-Smad 與 Smad 家族中的另一成員 Co-Smad（cmad），，即 Smad4 形成復合物(Lagna et al. 1996; Zhang et al. 1996)。這種積累，通常與其他轉錄因子共同對基因表達進行正向或負向調控(Fen受到配體刺激前，Smad4 均勻分布于細胞核與細胞質中，R-Smad 更傾。受到配體刺激后，兩者都在細胞核內聚集(Dijke et al. 2006)。另hibitory Smads），包括 Smad6 及 Smad7，他們通過阻礙受體復合物(Ebihi et al. 2004)、R-smad/Co-Smad 復合物形成(Hata et al. 1998)或阻礙 S(Bai et al. 2000)對 TGF-β 信號通路進行負反饋調節(jié)。
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S858.23

【參考文獻】

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本文編號：2522628