【摘要】：鴨坦布蘇病毒病是鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)引起的以產(chǎn)蛋下降、生長遲緩為主要特征的鴨新發(fā)傳染病,肉鴨及蛋鴨均能感染該病。該病群內(nèi)發(fā)病率能達到100%,死淘率為5%~15%。免疫接種是預防與控制該病的關(guān)鍵性措施之一,研制安全、有效,且能夠有效區(qū)分疫苗免疫和野毒感染的新型疫苗對該病的防控至關(guān)重要。鴨坦布蘇病毒囊膜蛋白E蛋白構(gòu)成DTMUV的主要抗原表位,與病毒的吸附有關(guān),誘導機體產(chǎn)生特異性中和抗體,引起保護性免疫反應(yīng)。本研究首先構(gòu)建了表達DTMUV E蛋白的重組腺病毒疫苗,并對其免疫效果的進行初步分析。根據(jù)鴨坦布蘇病毒AH-F10株(GenBank登錄號:KM102539)的E基因序列設(shè)計了一對特異性引物。提取鴨坦布蘇病毒的RNA,并擴增目的基因。將目的基因連接至穿梭載體pacAd-CMV K-NpA中。將PCR、酶切及測序鑒定正確的重組穿梭質(zhì)粒用Pac I酶線性化,之后與同樣經(jīng)Pac I酶線性化的骨架載體pacAd5 9.2-100共轉(zhuǎn)染AAV-293細胞,包裝出重組腺病毒rAd-E。將rAd-E感染AAV-293細胞,連續(xù)傳代,均可產(chǎn)生明顯細胞病變,表明rAd-E具有良好的遺傳穩(wěn)定性。檢測第8代重組腺病毒滴度,TCID50為10-6.17/0.1mL。間接免疫熒光和Western blotting試驗結(jié)果表明,重組腺病毒可以在體外表達E蛋白,且該表達的重組E蛋白具有良好的反應(yīng)原性。應(yīng)用構(gòu)建的表達E蛋白的重組腺病毒載體進行了免疫保護試驗。將7日齡健康雛鴨隨機分成4組,分別免疫重組腺病毒rAd-E,免疫劑量為108TCID50、鴨坦布蘇病毒病AH-F10株油乳滅活苗(陽性對照),免疫劑量為0.5m L、wt Ad免疫劑量為108TCID50、PBS注射0.5mL,2周后用同等劑量加強免疫一次。免疫前后分別對各組試驗鴨頸靜脈采血,分離血清,進行DTMUV特異性抗體、中和抗體檢測,同時分離外周血進行淋巴細胞增殖試驗。二次免疫后2周進行攻毒保護試驗。應(yīng)用DTMUV AH-TL15野毒株攻毒所有雛鴨,攻毒劑量為0.5mL(ELD50為10-2.38/0.1mL)。記錄發(fā)病及死亡情況,并剖檢存活鴨只,制作病理切片。結(jié)果顯示,重組腺病毒rAd-E免疫雛鴨后1周可誘導鴨坦布蘇病毒特異性抗體的產(chǎn)生,抗體水平顯著高于PBS組和wtAd組,但低于陽性對照組;中和抗體滴度最高達到1:16,低于陽性對照組,PBS組和wtAd組均未檢測到中和抗體。淋巴細胞增殖試驗結(jié)果顯示rAd-E組的刺激指數(shù)最高,陽性對照組次之,且兩組之間差異顯著(P0.05);IL-4和IFN-γ蛋白含量也顯著高于陽性對照組,表明重組腺病毒免疫組有效地誘發(fā)了細胞免疫反應(yīng)。攻毒保護試驗和HE染色結(jié)果顯示陽性對照組雛鴨的保護率達到100%,重組腺病毒的保護率達到80%,PBS組和wtAd組雛鴨全部發(fā)病。陽性對照組和重組腺病毒組的各組織沒明顯病變,PBS組和wtAd組的肝臟空泡變性、脾臟和胰臟淋巴細胞浸潤、腦組織有血管周圍袖套,有噬神經(jīng)細胞現(xiàn)象。說明重組腺病毒載體疫苗對鴨坦布蘇病毒有較好的保護作用。綜上所述,構(gòu)建的表達E蛋白的重組腺病毒rAd-E,能誘導健康鴨產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答,且對野毒攻毒有較好保護雛鴨抵御DTMUV感染。研究結(jié)果為DTMUV感染防控及其基因工程疫苗的研究提供重要參考。
【圖文】：

腺病毒 DNA 復制的起始時間，基因組分為早期基因(E)和晚期基是腺病毒復制的必需基因，是病毒基因活動的起始因子；E2 區(qū)與區(qū)為復制非必需區(qū)；E4 區(qū)編碼產(chǎn)物與與病毒 DNA 復制相關(guān)。晚期要是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白[72]。毒的 E1、E3 和 E4 區(qū)的上游區(qū)域能夠插入外源基因而不影響病2]。如今的腺病毒載體通過改造，包裝容量大，且細胞毒性弱。動子，能使得外源基因高效表達，而且表達的蛋白進行翻譯后，一定的空間形態(tài)[73, 74]，因此免疫效力較高。毒作為載體有以下優(yōu)點：(1)由于是復制缺陷性載體，，目的基因在游離狀態(tài)下表達，安全性好；(2)腺病毒結(jié)構(gòu)及特性已研究清楚，操作；(3)宿主范圍廣，可感染分裂期或非分裂期細胞和組織，且Fig. 1-2 Diagram of adenovirus structurereamstime.com/royalty-free-stock-images-structure-adenovirus-vector-diagram-morphology-as-most-commonly-cause-respiratory-illness-upper-respiratory-tract-image34731829）Fig. 1-2 Diagram of adenovirus structure圖 1- 2 腺病毒結(jié)構(gòu)示意圖

2 結(jié)果與分析組腺病毒的構(gòu)建結(jié)果E 基因的擴增結(jié)果取鴨坦布蘇病毒 RNA，以設(shè)計的 E 基因引物進行擴增后。獲得到 1 條，與預期大小相符（圖 2-1），測序鑒定結(jié)果與目的序列一致。重組穿梭質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果測序正確的片段與穿梭質(zhì)粒pacAd5 CMVK-NpA分別用EcoR I和B凝膠回收純化后進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 DH5α中，挑單菌落提取質(zhì)粒，用EcoR I和BamH I酶切鑒定，可見2條大小分別為6200b片段，符合預期（圖 2-2），表明重組穿梭質(zhì)粒 pacAd-E 構(gòu)建成功。bpM 1bpM 1
【學位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S858.32

【參考文獻】

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1 王勇;殷冬冬;宮曉華;王瑞;許漩;唐井玉;蘭夢蝶;王桂軍;;鴨坦布蘇病毒E蛋白的原核表達及多克隆抗體的制備[J];中國微生態(tài)學雜志;2016年02期

2 傅秋玲;陳珍;施少華;傅光華;程龍飛;陳紅梅;萬春和;林建生;黃瑜;;鴨坦布蘇病毒E蛋白包被抗原間接ELISA方法的建立[J];福建農(nóng)業(yè)學報;2015年01期

3 施少華;程龍飛;傅光華;陳紅梅;萬春和;傅秋玲;林建生;黃瑜;;鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白的原核表達[J];福建農(nóng)業(yè)學報;2014年10期

4 劉宗梁;付鈺廣;吉艷紅;李郁;魏建忠;朱啟運;;鴨坦布蘇病毒E蛋白膜外區(qū)的原核表達與鑒定[J];中國獸醫(yī)科學;2013年08期

5 劉志剛;孫青松;姚蓉;劉冰心;晁行周;鄒忠;劉立峰;吳彥;鄭愛芳;趙蘇紅;金梅林;;鴨坦布蘇病毒研究進展[J];中國動物傳染病學報;2013年01期

6 郜巖;孫茂盛;;腺病毒載體的研究進展及其在輪狀病毒疫苗研究中的應(yīng)用[J];中國生物制品學雜志;2012年03期

7 朱麗萍;顏世敢;;鴨坦布蘇病毒研究進展[J];中國預防獸醫(yī)學報;2012年01期

8 劉友生;彭春香;傅光華;侯東軍;施少華;萬春和;程龍飛;陳紅梅;林建生;林芳;黃瑜;;2010～2011年中國部分地區(qū)禽坦布蘇病毒感染調(diào)查及分子變異分析[J];中國動物傳染病學報;2012年01期

9 趙圓圓;李傳峰;朱良強;詹松鶴;王漢清;魏建忠;秦愛建;劉光清;王桂軍;;鴨產(chǎn)蛋下降-死亡綜合征的臨床診斷與病原的初步鑒定[J];揚州大學學報(農(nóng)業(yè)與生命科學版);2011年03期

10 蘇敬良;;引起鴨產(chǎn)蛋下降綜合征的BYD病毒感染研究[J];中國家禽;2011年17期

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1 王楠楠;坦布蘇病毒AH-F10株E蛋白的原核表達及熒光定量PCR檢測方法的建立[D];安徽農(nóng)業(yè)大學;2015年

2 趙立媛;雛鴨感染坦布蘇病毒后的排毒規(guī)律及病毒在血液、組織中含量變化的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2015年

3 楊少艷;鴨坦布蘇病毒E和NS1基因序列分析及其重組蛋白的初步應(yīng)用[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2013年

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本文編號：2517288