【摘要】：將完整的pAPN序列通過同源重組克隆入慢病毒表達(dá)載體pLVX-mCherry,并將該重組質(zhì)粒pLVX-mCherry-pAPN與慢病毒包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2、pLP-VSVG共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,在293T細(xì)胞中包裝成含目的基因的重組慢病毒。將收獲的重組病毒感染Vero細(xì)胞,經(jīng)過嘌呤霉素篩選和細(xì)胞有限稀釋法,篩選出表達(dá)pAPN的細(xì)胞。通過RT-PCR和間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)證明了所獲細(xì)胞株能夠穩(wěn)定表達(dá)pAPN蛋白,命名為Vero-APN-B6。IFA試驗(yàn)和TCID50試驗(yàn)結(jié)果表明:與Vero細(xì)胞相比,Vero-APN-B6更能促進(jìn)豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的增殖。利用該細(xì)胞株成功地從豬小腸組織中分離到了PEDV SC-MS株;經(jīng)過鑒定該毒株為變異毒株。
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圖片說明： 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)第47卷圖2熒光顯微鏡下觀察mCherry熒光Fig.2ThemCherryfluorescenceinfluorescencemicroscopyA：293T細(xì)胞轉(zhuǎn)慢病毒重組表達(dá)載體與包裝質(zhì)粒；B：293T細(xì)胞轉(zhuǎn)空載體與包裝質(zhì)粒A：293TtransfectedpLVX-mCherry-pAPNandlentiviralpackagingplas；mBid：s293Ttransfectedemptyvectorandlentiviralpackagingplasmids圖3pAPN的RT-PCR檢測(cè)（A）和pAPN的IFA檢測(cè)（B）及對(duì)照細(xì)胞（C）Fig.3DetectionofpAPNgenebyRT-PCR（A）anddetectionofpAPNinVerocellsbyIFA（B）aswellascontrolcells（C）M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pAPN擴(kuò)增產(chǎn)物；2：陰性對(duì)照M：DL5000DNAMarker；1：PCRproductfrompAPN；2：Negativecontrol圖1pAPN的擴(kuò)增（A）和重組質(zhì)粒的酶切鑒定（B）Fig.1AmplificationofpAPN（A）andidentifictionofre-combinantplasmidpLVX-mCherry-APNwithrestrictionenzymedigestion（B）M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pAPN擴(kuò)增產(chǎn)物；2：pLVX-mCherry-APN雙酶切產(chǎn)物；3：pLVX-mCherry-APN質(zhì)粒未酶切產(chǎn)物M：DL5000DNAMarker；1：PCRproductfrompAPN；2：ProductsfrompLVX-mCherry-APNdigestedwithBamHI+XbaⅠ；3：pLVX-mCher-ry-APN3B），而對(duì)照的正常Vero細(xì)胞無熒光（見圖3C）。2.4細(xì)胞系單克隆篩選和穩(wěn)定性鑒定將Vero-APN按有限稀釋法鋪96孔細(xì)胞板，挑選含單個(gè)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞孔，IFA鑒定該細(xì)胞孔為陽(yáng)性（見圖4A、B），，將該陽(yáng)性孔中細(xì)胞命名為Vero-APN-B6。對(duì)陽(yáng)性孔中的細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，分別取第5、15代的細(xì)胞進(jìn)行IFA和Western-blot鑒定的結(jié)果（見圖4C、D、E、F、G、H）表明，這些細(xì)胞均可穩(wěn)定表達(dá)該蛋白。2.5Vero-APN-B6對(duì)PEDV易感性為研究Vero-APN-B6細(xì)胞株與正常的Vero細(xì)胞對(duì)PEDV的易感性差別，將TCID50為1×102.5和1×102.8
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圖片說明： 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)第47卷圖2熒光顯微鏡下觀察mCherry熒光Fig.2ThemCherryfluorescenceinfluorescencemicroscopyA：293T細(xì)胞轉(zhuǎn)慢病毒重組表達(dá)載體與包裝質(zhì)粒；B：293T細(xì)胞轉(zhuǎn)空載體與包裝質(zhì)粒A：293TtransfectedpLVX-mCherry-pAPNandlentiviralpackagingplas；mBid：s293Ttransfectedemptyvectorandlentiviralpackagingplasmids圖3pAPN的RT-PCR檢測(cè)（A）和pAPN的IFA檢測(cè)（B）及對(duì)照細(xì)胞（C）Fig.3DetectionofpAPNgenebyRT-PCR（A）anddetectionofpAPNinVerocellsbyIFA（B）aswellascontrolcells（C）M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pAPN擴(kuò)增產(chǎn)物；2：陰性對(duì)照M：DL5000DNAMarker；1：PCRproductfrompAPN；2：Negativecontrol圖1pAPN的擴(kuò)增（A）和重組質(zhì)粒的酶切鑒定（B）Fig.1AmplificationofpAPN（A）andidentifictionofre-combinantplasmidpLVX-mCherry-APNwithrestrictionenzymedigestion（B）M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pAPN擴(kuò)增產(chǎn)物；2：pLVX-mCherry-APN雙酶切產(chǎn)物；3：pLVX-mCherry-APN質(zhì)粒未酶切產(chǎn)物M：DL5000DNAMarker；1：PCRproductfrompAPN；2：ProductsfrompLVX-mCherry-APNdigestedwithBamHI+XbaⅠ；3：pLVX-mCher-ry-APN3B），而對(duì)照的正常Vero細(xì)胞無熒光（見圖3C）。2.4細(xì)胞系單克隆篩選和穩(wěn)定性鑒定將Vero-APN按有限稀釋法鋪96孔細(xì)胞板，挑選含單個(gè)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞孔，IFA鑒定該細(xì)胞孔為陽(yáng)性（見圖4A、B），將該陽(yáng)性孔中細(xì)胞命名為Vero-APN-B6。對(duì)陽(yáng)性孔中的細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，分別取第5、15代的細(xì)胞進(jìn)行IFA和Western-blot鑒定的結(jié)果（見圖4C、D、E、F、G、H）表明，這些細(xì)胞均可穩(wěn)定表達(dá)該蛋白。2.5Vero-APN-B6對(duì)PEDV易感性為研究Vero-APN-B6細(xì)胞株與正常的Vero細(xì)胞對(duì)PEDV的易感性差別，將TCID50為1×102.5和1×102.8
【作者單位】： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)科研項(xiàng)目(KJQN201619)
【分類號(hào)】：S852.651

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本文編號(hào)：2515986