【摘要】：自2014年美國(guó)首次報(bào)道豬Delta冠狀病毒(PDCoV)以來(lái),該病毒相繼在我國(guó)一些豬場(chǎng)檢測(cè)到,由于其發(fā)病癥狀和病理剖檢與豬流行性腹瀉(PED)極其相似,且易出現(xiàn)混合感染,臨床很難區(qū)分,給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失,因此建立能夠同時(shí)檢測(cè)且能區(qū)分這兩種病毒感染的診斷方法,對(duì)于臨床實(shí)踐具有重要意義。根據(jù)GenBank中登錄的PDCoV和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)基因序列,設(shè)計(jì)了2對(duì)分別用于擴(kuò)增PDCoV N基因和PEDV M基因的目的片段的引物,通過(guò)對(duì)RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了同時(shí)檢測(cè)PDCoV和PEDV的雙重RT-PCR檢測(cè)方法,并對(duì)該方法進(jìn)行了靈敏性、特異性和重復(fù)性研究。結(jié)果顯示,該雙重RT-PCR對(duì)PD-CoV和PEDV的最低檢測(cè)量分別是3.14×10~3 copies/μL和3.88×10~4 copies/μL。該方法僅對(duì)PDCoV和PEDV檢測(cè)為陽(yáng)性,對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、博卡病毒(PBoV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬偽狂犬病毒(PRV)等豬常見(jiàn)的感染病毒的擴(kuò)增均為陰性,說(shuō)明該方法具有較好的特異性。用建立的雙重RT-PCR方法對(duì)111份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),其中PDCoV陽(yáng)性樣品22份,陽(yáng)性率為19.82%,PEDV陽(yáng)性樣品27份,陽(yáng)性率為24.32%,PDCoV和PEDV共感染的樣品數(shù)為10份,陽(yáng)性率為9.01%。本試驗(yàn)所建立的雙重RT-PCR方法能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)PDCoV和PEDV單一或混合感染的臨床樣品進(jìn)行快速檢測(cè),為臨床上對(duì)PDCoV和PEDV鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查研究提供了新的技術(shù)手段。
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圖片說(shuō)明： 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)第47卷圖1PDCoV和PEDV單一和雙重RT-PCR擴(kuò)增Fig.1ThesingleandduplexRT-PCRproductsofPDCoVandPEDVM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：PDCoV和PEDV的雙重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2：PDCoV單重PCR產(chǎn)物；3：PEDV單重PCR產(chǎn)物；4：陰性對(duì)照M：DL1000DNAMarker；1：TheamplificationproductsofPEDVandPDCoV；2：TheamplificationproductofPDCoV；3：TheamplificationproductofPEDV；4：Negativecontrol圖2多重RT-PCR的特異性試驗(yàn)Fig.2SpecificityoftheduplexRT-PCRforPEDVandPDCoVdetectionM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：PDCoV和PEDV多重PCR擴(kuò)增；2～7：分別是PDCoV、PEDV、TGEV、PBoV、PRRSV、PRV的PCR產(chǎn)物；8：陰性對(duì)照M：DL2000DNAMarker；1：TheduplexRT-PCRproductsofPDCoVandPEDV；2-7：ThePCRproductsofPDCoV，PEDV，TGEV，PBoV，PRRSVandPRV；8：Negativecontrol2.2PDCoV和PEDV雙重RT-PCR的特異性試驗(yàn)分別以PDCoV和PEDV的單一及混合質(zhì)粒，TGEV和PRRSV的cDNA，PBoV和PRV的DNA為模板，應(yīng)用建立的方法進(jìn)行多重RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，僅PDCoV、PEDV組能擴(kuò)出特異性條帶，且與目的片段大小相符合，而其他病毒均未擴(kuò)增出條帶（見(jiàn)圖2）。圖3多重RT-PCR的敏感性試驗(yàn)Fig.3SensitivitytestofduplexRT-PCRM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～9：109～100copies/L；10：陰性對(duì)照M：DL2000DNAMarker；1-9：109～100copies/L；10：Negativecontrol圖4雙重RT-PCR的重復(fù)性試驗(yàn)Fig.4RepeatabilitytestofduplexRT-PCRofPDCoVandPEDVA、B和C：分別代表第一、三和五周的RT-PCR；M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：PDCoV；2：PDCoVandPEDV；3：PEDV；4：陰性對(duì)照A，BandC：Thefirst，thirdandfifthweekofRT-PCR，respectively；1：PDCoV；2：PDCoVandPEDV；3：PEDV；
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圖片說(shuō)明： 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)第47卷圖1PDCoV和PEDV單一和雙重RT-PCR擴(kuò)增Fig.1ThesingleandduplexRT-PCRproductsofPDCoVandPEDVM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：PDCoV和PEDV的雙重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2：PDCoV單重PCR產(chǎn)物；3：PEDV單重PCR產(chǎn)物；4：陰性對(duì)照M：DL1000DNAMarker；1：TheamplificationproductsofPEDVandPDCoV；2：TheamplificationproductofPDCoV；3：TheamplificationproductofPEDV；4：Negativecontrol圖2多重RT-PCR的特異性試驗(yàn)Fig.2SpecificityoftheduplexRT-PCRforPEDVandPDCoVdetectionM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：PDCoV和PEDV多重PCR擴(kuò)增；2～7：分別是PDCoV、PEDV、TGEV、PBoV、PRRSV、PRV的PCR產(chǎn)物；8：陰性對(duì)照M：DL2000DNAMarker；1：TheduplexRT-PCRproductsofPDCoVandPEDV；2-7：ThePCRproductsofPDCoV，PEDV，TGEV，PBoV，PRRSVandPRV；8：Negativecontrol2.2PDCoV和PEDV雙重RT-PCR的特異性試驗(yàn)分別以PDCoV和PEDV的單一及混合質(zhì)粒，TGEV和PRRSV的cDNA，，PBoV和PRV的DNA為模板，應(yīng)用建立的方法進(jìn)行多重RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，僅PDCoV、PEDV組能擴(kuò)出特異性條帶，且與目的片段大小相符合，而其他病毒均未擴(kuò)增出條帶（見(jiàn)圖2）。圖3多重RT-PCR的敏感性試驗(yàn)Fig.3SensitivitytestofduplexRT-PCRM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～9：109～100copies/L；10：陰性對(duì)照M：DL2000DNAMarker；1-9：109～100copies/L；10：Negativecontrol圖4雙重RT-PCR的重復(fù)性試驗(yàn)Fig.4RepeatabilitytestofduplexRT-PCRofPDCoVandPEDVA、B和C：分別代表第一、三和五周的RT-PCR；M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：PDCoV；2：PDCoVandPEDV；3：PEDV；4：陰性對(duì)照A，BandC：Thefirst，thirdandfifthweekofRT-PCR，respectively；1：PDCoV；2：PDCoVandPEDV；3：PEDV；
【作者單位】： 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院;河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0500102) 河南省科技開(kāi)放合作項(xiàng)目(152106000047)
【分類號(hào)】：S852.651

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7 高慎陽(yáng);王s

本文編號(hào)：2515874