【摘要】：日本血吸蟲病(schistosomiasis)是制約我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、危害我國(guó)人民健康的重要的人畜共患病之一。吡喹酮是目前唯一一種大規(guī)模使用的治療血吸蟲病的藥物,但已有喹酮耐藥蟲株出現(xiàn)的報(bào)道,使治療血吸蟲病新藥物研發(fā)更加緊迫。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲在不同適宜性宿主體內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育情況與蟲體體細(xì)胞凋亡現(xiàn)象具有一定的相關(guān)性,這為血吸蟲病新藥物靶標(biāo)的篩選提供了新的思路。日本血吸蟲凋亡誘導(dǎo)因子Sj AIF是位于線粒體內(nèi)膜的一種蛋白,具有氧化還原酶和促凋亡功能。本課題組前期工作鑒定到了Sj AIF的堿基序列,為了闡述該基因的生物學(xué)特性和功能,本文展開了以下研究。1日本血吸蟲凋亡誘導(dǎo)因子編碼基因的克隆表達(dá)及生物學(xué)特性分析通過PCR擴(kuò)增獲得日本血吸蟲凋亡誘導(dǎo)因子Sj AIF基因的功能區(qū)片段,大小為828 bp,編碼276個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明該蛋白不含信號(hào)肽,理論等電點(diǎn)為6.61。對(duì)目的基因的功能結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)該基因片段包含一個(gè)4Lii(人線粒體凋亡誘導(dǎo)因子1)的功能區(qū)、一個(gè)吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族蛋白功能區(qū)及一個(gè)FAD/NAD(P)結(jié)合域超家族成員蛋白功能區(qū)。多重比對(duì)結(jié)果表明該基因所編碼的氨基酸序列與埃及血吸蟲的AIF相似性最高,達(dá)到68%。把擴(kuò)增到的日本血吸蟲凋亡誘導(dǎo)因子的功能區(qū)片段重組到原核表達(dá)載體p ET-28a,構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒p ET-28a-Sj AIF,并在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)其表達(dá),SDS-PAGE分析表明重組蛋白分子量約為35 k D。實(shí)時(shí)定量PCR分析表明Sj AIF基因在童蟲和成蟲的各個(gè)發(fā)育階段均有轉(zhuǎn)錄,其中7 d、14 d和21 d蟲體表達(dá)量較低,42 d和28 d蟲體表達(dá)量較高,雌蟲表達(dá)量高于雄蟲。同時(shí),對(duì)Sj AIF在血吸蟲非適宜宿主大鼠和適宜宿主小鼠來源蟲體中的表達(dá)差異進(jìn)行分析,結(jié)果表明,Sj AIF在大、小鼠來源的14 d,23 d,32 d,42 d四個(gè)時(shí)期蟲體中均有表達(dá),且在這四個(gè)時(shí)期中大鼠來源蟲體的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于小鼠來源蟲體。Western blotting結(jié)果表明重組蛋白具有較好的抗原性和免疫原性。ELISA分析表明重組蛋白免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生了較高水平的特異性Ig G抗體。應(yīng)用免疫組化分析顯示該蛋白主要存在于日本血吸蟲體被,少部份分布于實(shí)質(zhì)組織中。2 Sj AIF真核重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞中的表達(dá)分析通過PCR技術(shù)擴(kuò)增到Sj AIF功能區(qū)片段,成功構(gòu)建了真核重組表達(dá)質(zhì)粒pc DNA3.1(+)-Sj AIF,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞。Western blotting分析結(jié)果表明重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞中成功表達(dá),分子量大小約為31 k D,流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞早期凋亡比例為35.35%,而對(duì)照組為6.7%,實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞晚期凋亡比例為4.53%,對(duì)照組為0.7%。實(shí)驗(yàn)組的早期凋亡和晚期凋亡比例均明顯高于對(duì)照組。推測(cè)日本血吸蟲凋亡誘導(dǎo)因子Sj AIF有一定的促凋亡作用。本文為深入開展Sj AIF的生物學(xué)功能分析,及篩選針對(duì)Sj AIF的藥物靶標(biāo)提供了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2489281