發(fā)布時(shí)間：2019-05-18 08:28

【摘要】：為獲得牛支原體(Mycoplasma bovis,M.bovis)VspX蛋白單克隆抗體,將編碼該蛋白的基因克隆、表達(dá)并純化,作為免疫原,以QuickAntibody-Mouse 5W為免疫佐劑,免疫BALB/c小鼠。經(jīng)3次免疫后,將小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,經(jīng)3次亞克隆篩選后,共獲得5株能穩(wěn)定分泌抗VspX蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1A8、3A3、3C12、3H9及4D11。亞型鑒定表明,3C12重鏈為IgG2b,其余4株為IgG1,輕鏈均為κ鏈。間接ELISA結(jié)果表明,5株細(xì)胞培養(yǎng)上清的抗體效價(jià)在1∶1×104~1∶2×105,腹水效價(jià)在1∶1×105~1∶8×105。選其中兩株雜交瘤細(xì)胞株3H9和4D11的腹水純化,進(jìn)行親和力測(cè)定,解離常數(shù)分別為6.3×109和7.8×109,屬高親和力抗體。Western blotting結(jié)果顯示,5株單抗均能與牛支原體發(fā)生特異性反應(yīng),而單抗4D11與羊無乳支原體標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G2和絲狀支原體絲狀亞種標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G3均不反應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,單抗4D11與牛支原體表面的VspX的結(jié)合呈劑量依賴性。間接免疫熒光結(jié)果表明,單抗4D11可以識(shí)別黏附到胚胎牛肺細(xì)胞上的重組VspX蛋白。本試驗(yàn)成功制備的單克隆抗體為VspX蛋白功能的研究奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:In order to obtain monoclonal antibody against bovine mycoplasma (Mycoplasma bovis,M.bovis) VspX protein, the gene encoding the protein was cloned, expressed and purified as immunogen. QuickAntibody-Mouse 5W was used as immune adjuvant to immunize BALB/c mice. After three times of immunization, the mouse spleen cells were fused with SP2/0 myeloma cells. After three subcloning and screening, five hybridoma cell lines, named 1A8, 3A3, 3H9 and 4D11, which could stably secrete anti-VspX protein antibodies, were obtained. The identification of subtypes showed that the 3C12 heavy chain was IgG2b, and the other four strains were IgG1, light chain. The results of indirect ELISA showed that the antibody titers of 5 cell culture smears were 1: 1 脳 10 ~ 4 ~ 1: 2 脳 10 ~ 5, and those of ascitic fluid were 1: 1 脳 10 ~ 5 ~ 1:8 脳 10 ~ 5. The ascitic fluid of two hybridoma cell lines 3H9 and 4D11 was purified and their affinity was determined. the dissociation constant was 6.3 脳 109 and 7.8 脳 109, respectively, which belonged to high affinity antibody. Western blotting results showed that the five McAbs could react specifically with Mycoplasma bovis. However, the monoclonal antibody 4D11 did not react with the standard strain PG2 and the standard strain PG3 of Mycoplasma filamentum. The results of flow cytometry showed that the binding of monoclonal antibody 4D11 to VspX on the surface of Mycoplasma bovis was dose-dependent. The results of indirect immunofluorescence showed that monoclonal antibody 4D11 could recognize the recombinant VspX protein attached to embryonic bovine lung cells. The monoclonal antibodies successfully prepared in this experiment laid a foundation for the study of the function of VspX protein.
【作者單位】： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(31302111、31272587) 中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(2013QC001)
【分類號(hào)】：S852.62

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