【摘要】：豬血凝性腦脊髓炎是由豬血凝性腦脊髓炎病毒（Porcine hemagglutinatingencephalomyelitis virus，PHEV）通過感染宿主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervoussystem，CNS）而引起的一種急性、高度接觸性傳染病，具有典型的嗜神經(jīng)特性，死亡率可高達(dá)20%~100%，給畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，亟需一種高效的抗病毒藥物來預(yù)防和治療該病。天然免疫反應(yīng)是早期防御病毒感染的第一道防線，IFN-β除了能通過抑制病毒的吸附、脫殼、轉(zhuǎn)錄等環(huán)節(jié)抑制病毒復(fù)制作用以外，還可以通過加強(qiáng)宿主體內(nèi)自然殺傷性細(xì)胞的吞噬作用來殺傷病毒，因此IFN-β是影響抗病毒效果的關(guān)鍵因素之一。前期實驗發(fā)現(xiàn)PHEV感染樹突狀細(xì)胞以及N2a細(xì)胞過程中也有相似的逃避免疫監(jiān)視并抑制IFN-β現(xiàn)象，因此PHEV對IFN-β的免疫逃逸有可能是導(dǎo)致免疫抑制因素之一。目前尚不明確PHEV導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷之前宿主的抗病毒免疫機(jī)制，因此擬建立的PHEV體內(nèi)動物感染模型和體外細(xì)胞感染模型不僅有利于研究PHEV免疫逃避機(jī)制，而且為進(jìn)一步探究IFN-β是否參與PHEV抗病毒免疫具有重要的意義。 首先，本實驗利用PHEV-67N株感染巨噬細(xì)胞（J774A.1細(xì)胞），并在感染后的不同時間，通過光學(xué)顯微鏡觀察、TCID50、免疫熒光（IFA）、ELISA和熒光定量PCR等方法，分別從病毒抗原分布、病毒感染滴度變化以及mRNA和蛋白水平對PHEV在J774A.1細(xì)胞上的增殖特性以及相關(guān)炎性因子的表達(dá)進(jìn)行分析。TCID50結(jié)果表明在32h～36h病毒處于增殖的最高峰，且感染后28h～36h病毒增殖速度最快。IFA結(jié)果顯示感染后8h就能檢測到綠色熒光，隨著感染時間的逐漸延長，出現(xiàn)熒光的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，至感染后36h～48h熒光強(qiáng)度達(dá)到最強(qiáng)，熒光定量PCR結(jié)果與IFA結(jié)果表明PHEV能在J774A.1細(xì)胞上復(fù)制增殖。熒光定量PCR結(jié)果顯示PHEV感染J774A.1細(xì)胞后IL-6、TNF-a、IL-1β表達(dá)量提高，，而IFN-β表達(dá)量則降低，PHEV在感染J774A.1細(xì)胞的過程中通過抑制IFN-β的表達(dá)而逃避機(jī)體免疫反應(yīng)。本實驗又從PHEV感染小鼠模型中提取大腦RNA特異性擴(kuò)增出IFN-β基因，利用帶有GST標(biāo)簽的pGEX-4T-1原核表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，并且成功建立了pGEX-4T-1-IFN-β融合蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)，實現(xiàn)了在大腸桿菌內(nèi)重組蛋白IFN-β的可溶性表達(dá)，經(jīng)過Western-blot和SDS-PAGE分析鑒定，成功得到了有活性的重組蛋白，為深入研究PHEV逃避機(jī)體的免疫反應(yīng)致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 為了進(jìn)一步探究IFN-β在細(xì)胞模型和動物模型中是否參與抗病毒免疫。首先成功構(gòu)建IFN-β實驗組和正常接毒組的細(xì)胞感染模型，分別收集12h、24h、32h、48h、60h不同時間2組樣品，利用IFA和熒光定量PCR研究PHEV復(fù)制增殖情況；然后在動物感染模型中，將有活性的IFN-β注射小鼠大腦，之后將PHEV-67N病毒液滴鼻接種于2組小鼠體內(nèi)，分別采集感染后不同時間2組腦組織樣本用于病理組織學(xué)觀察和熒光定量PCR檢測。在體內(nèi)感染小鼠腦組織和體外感染J774A.1細(xì)胞熒光定量PCR結(jié)果顯示，與正常接毒組相比，IFN-β實驗組能夠顯著抑制PHEV的復(fù)制增殖。通過觀察PHEV感染小鼠大腦的臨床狀態(tài)和病理組織學(xué)發(fā)現(xiàn)，在不同時間段正常接毒組均比IFN-β實驗組出現(xiàn)大量血管套、噬神經(jīng)現(xiàn)象和神經(jīng)元壞死等更嚴(yán)重的病理變化，而IFN-β實驗組在初期無顯著的病理變化并在后期只出現(xiàn)部分淤血和小部分神經(jīng)元變性壞死的現(xiàn)象。這些結(jié)果顯示重組IFN-β可以有效的抑制HEV的復(fù)制，IFN-β在PHEV感染早期有一定的抗病毒效果，在一定程度上有保護(hù)小鼠大腦皮質(zhì)免受PHEV的侵襲的作用。說明了IFN-β有抗HEV逃避天然免疫系統(tǒng)監(jiān)視的作用。以上結(jié)果為研究PEVE免疫逃避機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)，也提示我們可以將基因工程技術(shù)應(yīng)用于IFN-β對PHEV疾病的預(yù)防和治療。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S855.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳克研;趙傳博;賀文琦;陸慧君;高巍;常志廣;王麗;高豐;;豬血凝性腦脊髓炎病毒單克隆抗體的制備與鑒定[J];中國生物制品學(xué)雜志;2009年09期

本文編號：2476681