【摘要】：目的:本研究通過對患病和正常的中國美利奴羊不同個體的OLA-DQB1基因exon2基因進行單核苷酸多態(tài)性(SNPs)檢測,并用Haploview4.2軟件構(gòu)建其單倍型模塊,從而分析該基因SNP位點與布魯氏菌病易感性的關(guān)聯(lián)性,初步篩選與布病易感性相關(guān)的單倍型。本研究的目的通過借鑒人類在疾病與HLA-DQB1多態(tài)性關(guān)系研究中的經(jīng)驗,應(yīng)用在OLA-DQB1基因SNPs與綿羊相關(guān)疾病的關(guān)聯(lián)性分析上,可為綿羊抗病選育以及進一步研究MHC的抗病機理打下基礎(chǔ),為今后開展布魯氏菌抗性分子標記輔助選擇研究提供一定參考依據(jù),通過定位具有易感性的遺傳位點從而加快分子遺傳抗病育種的進程。方法:1、本研究運用虎紅平板凝集試驗對408只中國美利奴羊進行羊種布魯氏菌陰陽性血清檢測,之后采用PCR-SSCP技術(shù)檢測OLA-DQB1基因exon2的SNP位點,選取不同等位基因進行克隆測序,測序結(jié)果使用分子生物學(xué)軟件進行比對分析,將檢測到的SNPs及單氨基酸多態(tài)性(SAPs)分別與人的進行比較分析,再用Pop Gene1.32軟件對每個SNP位點的等位基因頻率和基因型頻率進行差異統(tǒng)計分析,從而分析其與布魯氏菌病易感性的相關(guān)性。2、挑選出44個布魯氏菌陽性和陰性的中國美利奴羊個體,采用PCR產(chǎn)物直接測序法對OLA-DQB1基因exon2的SNPs進行檢測,分析其Hardy-Weinberg是否達到平衡,并對篩選的SNPs做連鎖不平衡分析,而后使用Haploview4.2和PHASE2.1對符合篩選條件的SNPs構(gòu)建單倍型連鎖圖譜并推測可能存在的單倍型,與布病易感性進行關(guān)聯(lián)分析,初步推測與布病易感性相關(guān)的單倍型。結(jié)果:1、利用虎紅平板凝集試驗檢測羊種布魯氏菌感染的陰陽性,在408個中國美利奴羊個體中檢出332個布魯氏菌感染陰性個體,其余的76個為陽性個體,布魯氏菌感染陽性檢出率為18.63%。2、在中國美利奴羊OLA-DQB1基因exon2(270bp)的序列內(nèi)共檢測到43個SNPs,其中不存在插入和缺失位點,這些位點中包括41個簡約信息位點和2個非信息位點,而二態(tài)性的多態(tài)位點多達35個。對其相應(yīng)的氨基酸(89aa)序列進行分析,共發(fā)現(xiàn)了29個氨基酸多態(tài)位點,且所有突變均為有義突變。3、對HLA-DQB1基因exon2的多態(tài)性進行比對分析,結(jié)果共發(fā)現(xiàn)了56個SNPs和34個有義SAPs。與中國美利奴羊的遺傳變異位點相比,人類的SNPs和SAPs更為豐富,其中有7個SNPs位點和堿基變化均與中國美利奴羊的相同。4、在43個SNPs位點中,196 G/A位點的等位基因在病例-正常樣本中的分布存在極顯著差異(P0.01),其臨近的211C/T變異位點的等位基因頻率也具有顯著差異(P0.05)。針對所有檢測的SNP位點的基因型進行關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)196 G/A這個變異位點的基因型頻率在病例組和正常組中的分布存在顯著差異(P0.05)。5、根據(jù)連鎖不平衡和單倍型軟件的界面提示,設(shè)置SNPs的篩選條件用于構(gòu)建連鎖不平衡圖譜和單倍型,從檢出的多態(tài)位點中共篩選出20個符合條件的SNPs。經(jīng)連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)中國美利奴羊OLA-DQB1基因exon2存在6個LD Blocks,且每個Block中的SNPs之間存在強連鎖不平衡,將其依次命名為Block1-Block6。從連鎖不平衡圖譜可以看出,每個LD Block內(nèi)的SNPs位點數(shù)不盡相同。6、經(jīng)單倍型推測,由單倍型軟件篩選到的20個SNPs位點共構(gòu)建了6種單倍型,根據(jù)這些單倍型在病例組和對照組中的分布差異,發(fā)現(xiàn)Hap5這種單倍型在病例組和對照組中存在顯著差異,具有有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、分析中國美利奴羊OLA-DQB1基因的多態(tài)位點,在其exon2全長270bp內(nèi)共檢測到41簡約信息位點和29個氨基酸多態(tài)位點,說明該序列的確存在豐富的SNPs和SAPs,這與免疫基因編碼產(chǎn)物的多樣性相一致。2、由于綿羊與人的OLA-DQB1基因序列具有高度的同源性,因而對HLA-DQB1基因exon2的多態(tài)性進行分析,比對結(jié)果表明人類HLA-DQB1基因exon2的SNPs和SAPs均比中國美利奴羊的要豐富復(fù)雜許多。3、將中國美利奴羊OLA-DQB1基因exon2檢出的SNPs與布病易感性進行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果表明196G/A和211C/T在病例組和對照組中分別存在極顯著差異和顯著差異,且196號位對應(yīng)的基因型頻率也在兩個組別中出現(xiàn)了顯著差異,從而推測它們可能與布病易感性相關(guān),說明DQB1基因有可能參與到不同種類的抗原遞呈活動中。4、根據(jù)臨近SNPs之間存在連鎖不平衡的現(xiàn)象,關(guān)聯(lián)所有符合條件的SNPs,共發(fā)現(xiàn)了6個連鎖不平衡模塊,而且每個模塊中的SNPs之間存在強連鎖不平衡。通過篩選出的20個SNPs構(gòu)建了6種單倍型,發(fā)現(xiàn)Hap5這種單倍型與布病易感性呈差異顯著(P0.05),可初步推測該單倍型與綿羊布病易感性緊密相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S826;S858.26

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 鄭源強;吳巖;畢力夫;;布魯氏菌病檢測、防控措施與疫苗研究進展[J];內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2011年01期

2 高彥輝;趙麗軍;孫殿軍;顧愛華;張作文;董爾丹;;布魯氏菌病防治基礎(chǔ)研究現(xiàn)狀與展望[J];中國科學(xué):生命科學(xué);2014年06期

3 張鳳珍,翟靜,蔣漢明,孫凌云,張媛英,顧洪雁;人類單核苷酸多態(tài)性及其應(yīng)用[J];預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇;2004年05期

，

本文編號：2468663