【摘要】：目的:本研究通過(guò)對(duì)患病和正常的中國(guó)美利奴羊不同個(gè)體的OLA-DQB1基因exon2基因進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNPs)檢測(cè),并用Haploview4.2軟件構(gòu)建其單倍型模塊,從而分析該基因SNP位點(diǎn)與布魯氏菌病易感性的關(guān)聯(lián)性,初步篩選與布病易感性相關(guān)的單倍型。本研究的目的通過(guò)借鑒人類(lèi)在疾病與HLA-DQB1多態(tài)性關(guān)系研究中的經(jīng)驗(yàn),應(yīng)用在OLA-DQB1基因SNPs與綿羊相關(guān)疾病的關(guān)聯(lián)性分析上,可為綿羊抗病選育以及進(jìn)一步研究MHC的抗病機(jī)理打下基礎(chǔ),為今后開(kāi)展布魯氏菌抗性分子標(biāo)記輔助選擇研究提供一定參考依據(jù),通過(guò)定位具有易感性的遺傳位點(diǎn)從而加快分子遺傳抗病育種的進(jìn)程。方法:1、本研究運(yùn)用虎紅平板凝集試驗(yàn)對(duì)408只中國(guó)美利奴羊進(jìn)行羊種布魯氏菌陰陽(yáng)性血清檢測(cè),之后采用PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)OLA-DQB1基因exon2的SNP位點(diǎn),選取不同等位基因進(jìn)行克隆測(cè)序,測(cè)序結(jié)果使用分子生物學(xué)軟件進(jìn)行比對(duì)分析,將檢測(cè)到的SNPs及單氨基酸多態(tài)性(SAPs)分別與人的進(jìn)行比較分析,再用Pop Gene1.32軟件對(duì)每個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)分析,從而分析其與布魯氏菌病易感性的相關(guān)性。2、挑選出44個(gè)布魯氏菌陽(yáng)性和陰性的中國(guó)美利奴羊個(gè)體,采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法對(duì)OLA-DQB1基因exon2的SNPs進(jìn)行檢測(cè),分析其Hardy-Weinberg是否達(dá)到平衡,并對(duì)篩選的SNPs做連鎖不平衡分析,而后使用Haploview4.2和PHASE2.1對(duì)符合篩選條件的SNPs構(gòu)建單倍型連鎖圖譜并推測(cè)可能存在的單倍型,與布病易感性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,初步推測(cè)與布病易感性相關(guān)的單倍型。結(jié)果:1、利用虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)羊種布魯氏菌感染的陰陽(yáng)性,在408個(gè)中國(guó)美利奴羊個(gè)體中檢出332個(gè)布魯氏菌感染陰性個(gè)體,其余的76個(gè)為陽(yáng)性個(gè)體,布魯氏菌感染陽(yáng)性檢出率為18.63%。2、在中國(guó)美利奴羊OLA-DQB1基因exon2(270bp)的序列內(nèi)共檢測(cè)到43個(gè)SNPs,其中不存在插入和缺失位點(diǎn),這些位點(diǎn)中包括41個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和2個(gè)非信息位點(diǎn),而二態(tài)性的多態(tài)位點(diǎn)多達(dá)35個(gè)。對(duì)其相應(yīng)的氨基酸(89aa)序列進(jìn)行分析,共發(fā)現(xiàn)了29個(gè)氨基酸多態(tài)位點(diǎn),且所有突變均為有義突變。3、對(duì)HLA-DQB1基因exon2的多態(tài)性進(jìn)行比對(duì)分析,結(jié)果共發(fā)現(xiàn)了56個(gè)SNPs和34個(gè)有義SAPs。與中國(guó)美利奴羊的遺傳變異位點(diǎn)相比,人類(lèi)的SNPs和SAPs更為豐富,其中有7個(gè)SNPs位點(diǎn)和堿基變化均與中國(guó)美利奴羊的相同。4、在43個(gè)SNPs位點(diǎn)中,196 G/A位點(diǎn)的等位基因在病例-正常樣本中的分布存在極顯著差異(P0.01),其臨近的211C/T變異位點(diǎn)的等位基因頻率也具有顯著差異(P0.05)。針對(duì)所有檢測(cè)的SNP位點(diǎn)的基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)196 G/A這個(gè)變異位點(diǎn)的基因型頻率在病例組和正常組中的分布存在顯著差異(P0.05)。5、根據(jù)連鎖不平衡和單倍型軟件的界面提示,設(shè)置SNPs的篩選條件用于構(gòu)建連鎖不平衡圖譜和單倍型,從檢出的多態(tài)位點(diǎn)中共篩選出20個(gè)符合條件的SNPs。經(jīng)連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)中國(guó)美利奴羊OLA-DQB1基因exon2存在6個(gè)LD Blocks,且每個(gè)Block中的SNPs之間存在強(qiáng)連鎖不平衡,將其依次命名為Block1-Block6。從連鎖不平衡圖譜可以看出,每個(gè)LD Block內(nèi)的SNPs位點(diǎn)數(shù)不盡相同。6、經(jīng)單倍型推測(cè),由單倍型軟件篩選到的20個(gè)SNPs位點(diǎn)共構(gòu)建了6種單倍型,根據(jù)這些單倍型在病例組和對(duì)照組中的分布差異,發(fā)現(xiàn)Hap5這種單倍型在病例組和對(duì)照組中存在顯著差異,具有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、分析中國(guó)美利奴羊OLA-DQB1基因的多態(tài)位點(diǎn),在其exon2全長(zhǎng)270bp內(nèi)共檢測(cè)到41簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和29個(gè)氨基酸多態(tài)位點(diǎn),說(shuō)明該序列的確存在豐富的SNPs和SAPs,這與免疫基因編碼產(chǎn)物的多樣性相一致。2、由于綿羊與人的OLA-DQB1基因序列具有高度的同源性,因而對(duì)HLA-DQB1基因exon2的多態(tài)性進(jìn)行分析,比對(duì)結(jié)果表明人類(lèi)HLA-DQB1基因exon2的SNPs和SAPs均比中國(guó)美利奴羊的要豐富復(fù)雜許多。3、將中國(guó)美利奴羊OLA-DQB1基因exon2檢出的SNPs與布病易感性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果表明196G/A和211C/T在病例組和對(duì)照組中分別存在極顯著差異和顯著差異,且196號(hào)位對(duì)應(yīng)的基因型頻率也在兩個(gè)組別中出現(xiàn)了顯著差異,從而推測(cè)它們可能與布病易感性相關(guān),說(shuō)明DQB1基因有可能參與到不同種類(lèi)的抗原遞呈活動(dòng)中。4、根據(jù)臨近SNPs之間存在連鎖不平衡的現(xiàn)象,關(guān)聯(lián)所有符合條件的SNPs,共發(fā)現(xiàn)了6個(gè)連鎖不平衡模塊,而且每個(gè)模塊中的SNPs之間存在強(qiáng)連鎖不平衡。通過(guò)篩選出的20個(gè)SNPs構(gòu)建了6種單倍型,發(fā)現(xiàn)Hap5這種單倍型與布病易感性呈差異顯著(P0.05),可初步推測(cè)該單倍型與綿羊布病易感性緊密相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S826;S858.26

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2468663