【摘要】：H9N2亞型禽流感病毒自首次分離至今,己在全世界廣泛傳播,不但給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的損失,而且還嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。為了控制禽流感的傳播,禽流感疫苗被廣泛的應(yīng)用。但是由于禽流感病毒的RNA聚合酶缺乏校對(duì)機(jī)制,造成了禽流感病毒基因組RNA遺傳上的不穩(wěn)定性,變異率極高,而疫苗選擇壓更是會(huì)加速流感病毒的抗原變異,引起免疫失敗,甚至引發(fā)新的流行。本文中,我們用A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)禽流感病毒疫苗株(簡(jiǎn)稱(chēng)F株)免疫小鼠,成功制備五株針對(duì)F株的H9N2亞型禽流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體,利用這5株單克隆抗體,檢測(cè)了本實(shí)驗(yàn)室前期研究獲得的有和無(wú)同源疫苗抗體選擇壓下病毒的抗原變化,發(fā)現(xiàn)隨著傳代代次的增加,病毒的血凝抑制效價(jià)顯著下降：并且同源疫苗抗體下傳代病毒的血凝抑制效價(jià)下降得更早,表明同源疫苗抗體加速了流感病毒的抗原變異；進(jìn)一步研究表明,有一株單克隆抗體可能是針對(duì)F株的181位氨基酸所在的抗原表位的單抗。本論文的研究結(jié)果將為H9N2亞型禽流感病毒的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供一定的資源。1、H9N2亞型禽流感病毒血凝素蛋白單克隆抗體的制備經(jīng)10日齡SPF雞胚擴(kuò)增的F株病毒尿囊液差速離心后獲得純化的F株病毒,將純化的病毒蛋白作為免疫原,免疫6-8周齡的BALB/c小鼠；通過(guò)雜交瘤技術(shù),將免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,經(jīng)過(guò)三次間接ELISA篩選融合陽(yáng)性細(xì)胞；隨后用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行三次亞克隆,獲得五株能穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1D6、3G8、4A5、6B11和6C12。五株單克隆抗體的腹水效價(jià)分別為29、212、27、214、29,腹水的ELISA效價(jià)分別為1.0×105、1.6×106、3.2×106、3.2×106、2.0×105。特異性試驗(yàn)顯示五株單克隆抗體與H9亞型禽流感病毒發(fā)生血凝抑制(HI)反應(yīng),與H5亞型禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒、產(chǎn)蛋下降綜合癥病毒、新城疫病毒無(wú)任何交叉反應(yīng),證明本論文獲得的5株五株單克隆抗體具有良好的特異性：Western blot結(jié)果顯示五株單克隆抗體在75kd處出現(xiàn)特異的HA條帶,表明這五株單克隆抗體均為針對(duì)H9N2亞型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白的單抗。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明,這五株單克隆抗體可以用于免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)攻毒雞氣管組織中存在的H9N2亞型禽流感病毒。2、單克隆抗體在抗原變異上的初步應(yīng)用在前期研究中,本實(shí)驗(yàn)室用F株在有和無(wú)同源疫苗抗體選擇壓的SPF雞胚模型中進(jìn)行連續(xù)傳代,收集了第15代、30代、47代、50代和52代病毒。為研究同源疫苗選擇壓對(duì)禽流感病毒抗原變異的作用,本實(shí)驗(yàn)首先用5株單克隆抗體比較了有和無(wú)同源疫苗抗體選擇壓下同代次病毒的血凝抑制效價(jià)。發(fā)現(xiàn)隨著傳代代次的增加,病毒的血凝抑制效價(jià)顯著下降；并且有同源疫苗抗體下傳代的病毒血凝抑制效價(jià)下降得更早,表明同源疫苗抗體加速流感病毒的抗原變異。本實(shí)驗(yàn)室前期分析抗原變異的傳代病毒的序列發(fā)現(xiàn),其HA基因有4個(gè)氨基酸的突變。為探討HA的氨基酸位點(diǎn)在抗原變異中的作用,本論文通過(guò)RT-PCR,基因克隆等分子生物學(xué)方法,分別構(gòu)建了含有K131R、S145N、G181E和A198V四個(gè)突變(稱(chēng)為rFHA1)、 K131R、G181E和A198V三個(gè)突變(稱(chēng)為rFHA2)、以及G181E一個(gè)突變的HA(稱(chēng)為rFHA181),將這三種HA插入pCAGGS哺乳動(dòng)物載體中,分別稱(chēng)為pCA-rFHA1、 pCA-rFHA2、pCA-rFHA181;然后分別轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中表達(dá)HA蛋白；用本論文獲得的單克隆抗體經(jīng)ELISA檢測(cè)細(xì)胞中蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示單抗1D6與F株反應(yīng)良好,但是與pCA-rFHA1、pCA-rFHA2、pCA-rFHA181三種蛋白都不反應(yīng),其余四株單抗與pCA-rFHA1、pCA-rFHA2、pCA-rFHA181的ELISA效價(jià)水平較高。結(jié)果表明,單抗1D6的表位可能位于HA的181位,說(shuō)明HA的181位在抗原的變異中有一定的作用。由于本論文獲得的單克隆抗體的株數(shù)有限,沒(méi)有對(duì)其余三個(gè)突變進(jìn)行定性,還有待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.4

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本文編號(hào)：2450725