【摘要】：我國(guó)水禽養(yǎng)殖位居世界首位,每年有大量禽(如鵝)死于傳染性疾病,尤其是具有高傳染性、高致病性的新城疫病毒(New castle disease virus,NDV)。接種傳統(tǒng)雞用NDV疫苗不能有效預(yù)防鵝感染NDV。因此,應(yīng)該尋找其它方法來(lái)抑制病毒感染。其中一種可行的方法是通過(guò)飼養(yǎng)來(lái)刺激提高鵝的免疫系統(tǒng)。近些年來(lái),防御素(Avian beta-defensins,Av BDs)被認(rèn)為是脊椎動(dòng)物的重要天然免疫調(diào)節(jié)劑。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)特異性引物,利用RT-PCR方法從鵝體內(nèi)擴(kuò)增出四個(gè)新的鵝β-防御素:Av BD4、Av BD7、Av BD12、Av BD16,i NOS,7個(gè)Toll樣受體(TLR):TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15和8個(gè)細(xì)胞因子:白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、白細(xì)胞介素-18(IL-18)、γ干擾素(IFN-γ)、主要組織相容性復(fù)合體(MHC class I)、FAS配體(FASLG)。其中鵝Av BD4包含171個(gè)堿基,編碼56個(gè)氨基酸;鵝Av BD7、Av BD12、Av BD16分別由201個(gè)、198個(gè)、180個(gè)堿基組成,分別編碼66個(gè)、65個(gè)、59個(gè)氨基酸。經(jīng)同源性分析,鵝Av BD4與雞Av BD4同源性最高為80.9%;鵝Av BD7與鴨、雞Av BD7同源性最高為84.4%;鵝Av BD12與雞Av BD12同源性為87.4%;鵝Av BD16與鴨Av BD16同源性最高為66.3%。此外分析鵝TLRs、i NOS及細(xì)胞因子序列,結(jié)果顯示鵝TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15與鵝TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15同源性分別為:99%、100%、100%、100%、100%、100%;鵝IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-18、IFN-γ、MHC class I、FASLG與鵝IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-18、IFN-γ、MHC class I同源性為100%、100%、100%、100%、100%、100%、93%。而鵝TLR1、iNOS、FASLG與雞TLR1、i NOS、FASLG同源性為98%、90%、89%,所以將其命名為鵝TLR1、i NOS、FASLG。為研究新鵝β-防御素的生物學(xué)活性,采用His標(biāo)簽蛋白原核表達(dá)系統(tǒng),將四個(gè)基因分別亞克隆到pPro EX HTa上,構(gòu)建4個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosseta感受態(tài)中,用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),誘導(dǎo)后經(jīng)Tricine-SDS-PAGE電泳分析,誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白大部分都以包涵體形式存在。重組蛋白抗菌活性測(cè)定結(jié)果表明,四種重組蛋白對(duì)這五種菌均具有抗菌活性,且隨蛋白濃度的增加抑菌活性增強(qiáng)。此外,高濃度鹽離子抑制重組蛋白的抗菌活性。重組蛋白對(duì)雞紅細(xì)胞沒(méi)有溶血活性。為探討鵝β-防御素體內(nèi)抗NDV感染的作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)將20只40日齡的健康鵝,隨機(jī)分為兩組,其中對(duì)照組10只,攻毒組10只。攻毒組通過(guò)點(diǎn)眼、滴鼻的方式以每只鵝100 ul稀釋后的Go/CH/LHLJ/1/06NDV接種。對(duì)照組10只,不攻毒。攻毒組與對(duì)照組分別在攻毒后的36 h、72 h各取5只鵝頸部放血致死,采取呼吸、消化、免疫系統(tǒng)的氣管、肝臟、腺胃、肺臟、盲腸扁桃體、腎臟、脾臟、法氏囊、哈德氏腺、腦10個(gè)組織,采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法,從感染Go/CH/LHLJ/1/06病毒后36 h和72 h后的鵝10個(gè)組織中檢測(cè)Go/CH/LHLJ/1/06病毒含量、鵝β-防御素、iNOS、TLRs和細(xì)胞因子基因的含量,并且分析組織中病毒載量與鵝β-防御素的相關(guān)性。結(jié)果表明,對(duì)照組未檢測(cè)到Go/CH/LHLJ/1/06病毒,而攻毒后可在肺臟、腎臟、肝臟、腺胃、脾臟、盲腸扁桃體、法氏囊中檢測(cè)到Go/CH/LHLJ/1/06病毒,且攻毒后36 h和72 h在脾臟和肝臟中差異顯著。對(duì)脾臟組織中病毒含量和鵝β-防御素相關(guān)性分析,結(jié)果顯示,攻毒后36 h只有AvBD1、Av BD5、Av BD10、Av BD12、Av BD16與病毒載量呈現(xiàn)相關(guān)性,且只是Av BD12差異顯著(P0.05);攻毒后72 h Av BDs均呈現(xiàn)相關(guān)性,且Av BD4、Av BD5、Av BD6、Av BD9、Av BD10、Av BD12相關(guān)性差異顯著(P0.05或P0.01)。對(duì)目的基因檢測(cè)結(jié)果顯示,除了鵝Av BD3基因未檢測(cè)出來(lái)和TLR4分布局限以外,其余基因在組織中分布廣泛,其中鵝Av BD2、Av BD5、Av BD7、Av BD9和Av BD12在對(duì)照組和攻毒組36 h和72 h的檢測(cè)的是10個(gè)組織中均檢出,且表達(dá)差異不顯著(P0.05);鵝Av BD1、Av BD6、Av BD10基因不是在所有組織中都能檢測(cè)到,并且表達(dá)差異不顯著(P0.05);而鵝攻毒后72h鵝Av BD4基因在的腦、氣管和脾臟中表達(dá)量顯著下調(diào)(P0.05),鵝攻毒后36 h鵝Av BD16基因在的盲腸扁桃體和哈德氏腺組織中表達(dá)顯著上調(diào)(P0.05),在攻毒后72 h的腦組織中顯著下調(diào)(P0.05)。其中,鵝攻毒36 h后鵝TLR1基因在肺臟、盲腸扁桃體及哈德氏表達(dá)量上調(diào),在肝臟表達(dá)量下調(diào),且差異顯著(P0.05),在攻毒后72 h鵝TLR1在肝臟、盲腸扁桃體及法氏囊表達(dá)量上調(diào)且差異顯著(P0.05);鵝攻毒后72 h鵝TLR2基因在盲腸扁桃體表達(dá)量顯著上調(diào)(P0.05);鵝攻毒后72 h鵝TLR7基因在脾臟中顯著上調(diào)(P0.05)。鵝攻毒后與對(duì)照組相比鵝TLR3、TLR4、TLR5和TLR15基因表達(dá)量變化不顯著(P0.05)。此外,鵝攻毒后72 h鵝i NOS在脾臟中表達(dá)量顯著上調(diào)(P0.05),鵝攻毒后72 h鵝IFN-γ在法氏囊表達(dá)量顯著上調(diào)(P0.05),鵝攻毒后72 h鵝IL-8在盲腸扁桃體顯著上調(diào)(P0.05),鵝攻毒后36 h鵝MHC class I在哈德氏腺顯著上調(diào)(P0.05)。根據(jù)以上結(jié)果,選擇Av BD4和Av BD16用于體外抗NDV研究。結(jié)果表明,重組鵝Av BD4和Av BD16蛋白體外抑制NDV(Go/CH/LHLJ/1/06株)病毒復(fù)制作用不顯著。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)從鵝體內(nèi)分離出四個(gè)新的鵝β-防御素,其重組蛋白具有廣譜抗菌作用且受高濃度鹽離子影響,此外不具有溶血活性。此外,本實(shí)驗(yàn)還從鵝體內(nèi)克隆出i NOS、TLRs和細(xì)胞因子。經(jīng)Go/CH/LHLJ/1/06病毒誘導(dǎo)后,鵝Av BD4和AvBD16基因的表達(dá)量顯著變化。TLR1、TLR2、TLR7、IL-2、IL-8、IFN-γ表達(dá)量均顯著變化。重組鵝Av BD4、Av BD16蛋白對(duì)抑制Go/CH/LHLJ/1/06病毒復(fù)制不顯著。
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【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S855.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王立剛;王立賢;程篤學(xué);;動(dòng)物防御素研究進(jìn)展[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2007年03期

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本文編號(hào)：2449652