【摘要】：肝臟是機體的一個重要器官,參與機體的消化、吸收、解毒、物質(zhì)合成和代謝、免疫防御等過程,被形象的稱為機體的"加工廠"。肝臟對由消化道吸收來的營養(yǎng)物質(zhì)的代謝作用一直是科學家研究的焦點。然而,肝臟對由消化道轉(zhuǎn)移來的異常代謝產(chǎn)物的免疫防御作用的研究沒有受到足夠的重視。本文以裝有瘤胃瘺管和肝臟慢性多血管瘺的山羊和奶牛為試驗動物,研究在高精料日糧誘導的亞急性瘤胃酸中毒(SARA)狀態(tài)下,肝臟對消化道轉(zhuǎn)移來的LPS的清除效率,以及這些LPS對肝臟天然免疫反應的影響,并揭示相關(guān)表觀遺傳機理。最后通過乳腺接種E.coli的試驗進一步揭示肝臟中天然免疫基因表達過程中所發(fā)生的表觀遺傳修飾。1.消化道來源的LPS在山羊肝臟中的清除效率及其對肝臟免疫功能的影響肝臟對SARA狀態(tài)下由消化道轉(zhuǎn)移來的LPS的清除效率以及肝臟對這些LPS產(chǎn)生的免疫防御反應報道很少。本試驗中12只母波雜羊被隨機分為兩組,第一組飼喂高精料日糧(精:粗=6:4,n=6)誘導SARA作為處理組;第二組飼喂低精料日糧(精:粗=4:6,n=6)作為對照組。所有山羊均安裝瘤胃瘺管和門靜脈、肝靜脈、股動脈以及腸系膜靜脈血管插管。飼喂3周后,處理組中瘤胃pH5.6且持續(xù)時間3 h/d,說明SARA被成功誘發(fā)。飼喂6周之后,處理組中血流量和LPS的濃度在門靜脈、肝靜脈以及動脈中均顯著升高。肝臟的凈清除速率和清除比例統(tǒng)計結(jié)果顯示LPS清除速率顯著增加(5.46 EU/sec vs 2.83 EU/sec;處理組vs對照組),但是其清除比例卻降低(10.57%vs18.27%;處理組vs對照組),說明高精料日糧誘導的SARA引起活性LPS在肝臟內(nèi)的蓄積。處理組山羊外周血液中促炎癥細胞因子IL-1β(P0.01)和TNF-α(P0.01)以及急性期蛋白LBP(P0.01)、Hp(P=0.02)和SAA(P=0.02)濃度與對照組相比顯著升高,說明SARA可引起系統(tǒng)性的炎癥反應。另外,外周血液中生化指標ALT(P0.01)、ALP(P0.01)和T-BIL(P0.01)的濃度處理組中顯著高于對照組,說明SARA狀態(tài)下肝細胞的受到損傷。肝臟中免疫相關(guān)基因和TLR4蛋白的表達結(jié)果說明,高精料誘導的SARA使肝臟的免疫防御能力增強。本試驗研究表明,高精料日糧誘導的SARA導致消化道來源的LPS在肝臟中蓄積、外周血液中促炎癥細胞因子和急性期蛋白濃度升高,以及肝臟中免疫相關(guān)基因和TLR4蛋白表達顯著增強,從而提高了LPS在肝臟中的清除速率。然而,大量活性LPS的蓄積和過多細胞因子的產(chǎn)生導致了肝細胞受損,減弱了肝臟對LPS的清除能力,降低了LPS在肝臟中的清除比例。2.消化道來源的LPS對奶山羊肝臟中TLR4信號通路及其下游免疫基因表達的影響飼喂高精料日糧誘導的SARA可引起系統(tǒng)性炎癥反應,這種炎癥反應極有可能是被由消化道轉(zhuǎn)移進入循環(huán)系統(tǒng)的LPS引起的。本試驗研究的目的是揭示循環(huán)系統(tǒng)中LPS濃度增加與肝臟炎癥反應之間的因果關(guān)系。選用8只泌乳中期薩能奶山羊,安裝瘤胃瘺管及門靜脈血管插管,并隨機分配到飼喂高精料日糧(精:粗=6:4,n=4)的處理組(Treatment)和飼喂低精料日糧(精:粗=4:6,n=4)的對照組(Control)。處理組中瘤胃pH低于5.6的持續(xù)時間從第4周開始超過180min,說明SARA被成功誘發(fā)。8周之后,高精料日糧飼喂顯著降低了瘤胃pH、乳產(chǎn)量、乳脂率和乳糖,增加了瘤胃和門靜脈中LPS的濃度。mRNA定量結(jié)果顯示,高精料誘導的SARA導致肝臟中天然免疫基因的表達被增強。Western blotting結(jié)果顯示,肝臟中TLR4、NF-κB p65和磷酸化p65蛋白的量在處理組中顯著高于對照組。CHART-PCR和DNA甲基化分析發(fā)現(xiàn)SARA狀態(tài)下消化道來源的LPS顯著降低了肝臟中TLR4基因啟動子區(qū)域染色質(zhì)壓縮程度和DNA甲基化率。本試驗研究表明,高精料日糧誘導的SARA導致大量的LPS由消化道轉(zhuǎn)移經(jīng)門靜脈進入肝臟,降低了TLR4啟動子區(qū)域染色質(zhì)壓縮程度和DNA甲基化率,從而增強了肝臟中TLR4基因和蛋白的表達,激活了TLR4信號傳導通路,上調(diào)了天然免疫基因的表達,引起了肝臟的炎癥反應。因此,SARA狀態(tài)下肝臟中免疫基因表達增強受表觀遺傳機制的調(diào)控,為治療SARA引起的系統(tǒng)性炎癥反應開辟了一個新的途徑。3.消化道來源的LPS對奶牛肝臟中天然免疫基因表達的影響極其表觀機理的研究當免疫基因受到炎性因子刺激時,表觀遺機制在其表達過程中起到至關(guān)重要的作用。飼喂高精料日糧給奶牛引起的SARA可導致系統(tǒng)性炎癥反應已經(jīng)被廣泛報道,然而奶牛肝臟中天然免疫基因的表達調(diào)控是否與表觀遺傳機制有關(guān)還不清楚。本試驗研究選用8頭裝有瘤胃瘺管以及肝靜脈和門靜脈血管插管的泌乳中期奶牛,被隨機安排到飼喂高精料日糧(精:粗=6:4,n=4)的處理組中(Treatment),或者飼喂低精料日糧(精:粗=4:6,n=4)的對照組中(Control)。飼喂高精料日糧導致瘤胃pH5.6的持續(xù)時間大于180 min/d從4周之后出現(xiàn),說明SARA被成功誘發(fā)。飼喂10周之后,處理組中,瘤胃、門靜脈和肝靜脈中LPS的濃度顯著高于對照組。飼喂高精料日糧誘導的SARA導致免疫相關(guān)基因的表達顯著升高。免疫候選基因(TLR4、LBP、Hp和SAA3)啟動子區(qū)域的染色質(zhì)壓縮程度和DNA甲基化率在處理組中顯著低于對照組。相關(guān)性分析顯示免疫候選基因啟動子區(qū)域染色質(zhì)狀態(tài)與相應基因的表達呈極強的負相關(guān),與DNA甲基化水平呈正相關(guān)。本研究揭示了飼喂高精料日誘導的奶牛的SARA導致大量LPS從消化道轉(zhuǎn)移經(jīng)門靜脈進入肝臟,降低了免疫基因啟動子區(qū)域DNA甲基化率,使該區(qū)域染色質(zhì)呈疏松狀態(tài),進而增強肝臟免疫相關(guān)基因的表達。這一研究為生產(chǎn)實踐中通過使用表觀調(diào)節(jié)因子來保護患SARA奶牛的健康,維持生產(chǎn)性能提供了理論依據(jù)。4.乳腺接種E.coli對奶牛肝臟免疫基因表達的影響及表觀機理研究LPS是由革蘭氏陰性菌裂解釋放出來的,當機體受到這種細菌感染時,它可以導致TLR信號通路過渡激活,最終引起嚴重的全身反應。本試驗的目的是研究表觀遺傳學機制是否參與了這種全身反應的發(fā)生和發(fā)展過程。選用16頭泌乳中期奶牛隨機分為三組,第一組接種E.coli到右前、右后和左后三個乳區(qū)作為試驗一(HeavilyInfected,n=4),第二組接種E.coli到右后乳區(qū)作為試驗二(Gently Infected,n=7),第三組幾種等量的生理鹽水到右后乳區(qū)作為對照組(Control)。接種24h后屠宰采取肝臟樣品。CHART-PCR的結(jié)果顯示,乳腺接種E.coli 24 h之后導致奶牛肝臟中免疫基因(TLR4、TLR2、LBP和Hp)啟動子區(qū)域染色質(zhì)結(jié)構(gòu)呈疏松狀態(tài),并且mRNA的表達量增強。然而,在αS1-casein基因啟動子區(qū)域染色質(zhì)結(jié)構(gòu)無論是在試驗組還是對照組均呈疏松狀態(tài),接種E.coli沒有引起像免疫基因啟動子區(qū)域染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。DNA甲基化分析結(jié)果顯示,TLR4啟動子區(qū)域甲基化率的降低與其染色質(zhì)的疏松程度極其相關(guān)。本試驗結(jié)果表明乳腺接種E.coli可導致肝臟中天然免疫基因表達增強,表觀遺傳機制參與調(diào)控了它們的表達。這個結(jié)論為我們表觀遺傳機制可能是處理這些疾病的一個新措施。
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【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S816
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本文編號：2441741